Czy poziom NAD spada wraz z wiekiem w tkankach ludzkich?

W 2015 roku grupa naukowców z Uniwersytetu Minnesoty umieściła zdrowych ochotników w wysokopolowym skanerze rezonansu magnetycznego i odczytała poziom dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego z ich płatów potylicznych bez pobierania próbek. Widmo fosforu-31 rozdziela sygnały NAD+ i NADH, więc pomiar podaje zarówno wielkość obu pul, jak i stan redoks w nienaruszonym mózgu. U badanych ochotników poziom NADH wzrastał z wiekiem, a poziomy NAD+, całkowitego NAD oraz potencjał redoks NAD+/NADH spadały.

To badanie jest nieustannie cytowane i słusznie. Jest również jednym z bardzo niewielu pomiarów stojących za twierdzeniem, które teraz jest wysuwane rutynowo. Dlatego warto zadać proste pytanie bezpośrednio: czy poziom NAD spada wraz z wiekiem w ludzkiej tkance, jak uzyskano każdą liczbę i na czym dokładnie polega ten spadek?

Co jest mierzone, gdy ktoś mówi NAD

NAD występuje w czterech wzajemnie przekształcalnych postaciach: NAD+, NADH, NADP+ i NADPH. Pierwsza para przenosi jon wodorkowy w metabolizmie katabolicznym; druga jest źródłem równoważników redukcyjnych dla biosyntezy i obrony antyoksydacyjnej. Oznaczenie, które podaje “NAD” bez określenia, o którą postać i który stopień utlenienia chodzi, niewiele mówi.

NAD+ pełni drugą funkcję, istotną w tym kontekście. Jest zużywany, a nie tylko krąży w cyklu, jako substrat poli(ADP-rybozo)polimeraz (PARP) w naprawie DNA, sirtuin oraz glikohydrolazy CD38. Zużycie rozszczepia cząsteczkę i uwalnia nikotynamid, z którego NAD+ musi zostać ponownie zsyntetyzowany. Tkanka utrzymuje więc ciągły cykl rozkładu i odzysku, a stężenie zmierzone w danej chwili jest wypadkową dwóch szybkości, a nie samą szybkością.

Sam pomiar również nie jest trywialny. Trammell i Brenner zauważyli, że wysokosprawna chromatografia cieczowa z detekcją UV nie zapewnia swoistości i czułości potrzebnych do rzetelnego oznaczania metabolitów NAD w złożonych próbkach, dlatego opracowali celowaną metodę wykorzystującą HPLC sprzężoną ze spektrometrią mas; tłumienie jonizacji określonych związków opisują jako problem we wcześniej opublikowanym podejściu, który ich metoda musiała skorygować.

Czy stężenie NAD spada wraz z wiekiem w tkankach ludzkich?

Trzy zestawy danych pochodzące od ludzi mają największe znaczenie i obejmują trzy różne kompartmenty.

Badanie	Przedział	Metoda	Uczestnicy	Podany kierunek
Massudi i inni, PLoS ONE, 2012	Skóra miednicy	Biochemiczne oznaczenia na próbkach tkanek	49 dawców, od noworodków do osób w wieku 77 lat	NAD+ korelował ujemnie z wiekiem u mężczyzn (p = 0,001, r = -0,706) i u kobiet (p = 0,01, r = -0,537); aktywność PARP rosła z wiekiem u mężczyzn (p < 0,0001, r = 0,768) i korelowała odwrotnie z NAD+ w tkance (p = 0,0003, r = -0,639)
Zhu et al., PNAS, 2015	Mózg, in vivo	Spektroskopia rezonansu magnetycznego fosforu-31	Zdrowi ochotnicy	Zależny od wieku wzrost stężenia NADH; zależne od wieku spadki stężenia NAD+, całkowitego NAD oraz potencjału redoks NAD+/NADH
Clement et al., Rejuvenation Research, 2019	Osocze krwi	Chromatografia cieczowa sprzężona z tandemową spektrometrią mas	Zdrowi uczestnicy w wieku 20-87 lat	Spadek stężenia NAD+, NADP+ i NAAD; wzrost stężenia NADH, NADPH, nikotynamidu, N-metylo-nikotynamidu oraz ADP-rybozy; brak istotnych zmian dla kwasu nikotynowego, NMN i NAMN

Dwa szczegóły z tej tabeli zwykle gubią się w streszczeniach. Badanie skóry wykazało zależności głównie u mężczyzn; w tej samej kohorcie utlenianie lipidów i aktywność sirtuin korelowały z wiekiem u mężczyzn, a u kobiet nie. Z kolei badanie osocza w ogóle nie pokazuje jednolitego spadku – kilka metabolitów wzrosło, a trzy nie zmieniły się istotnie. Zdanie w rodzaju “NAD spada z wiekiem” upraszcza wzorzec, który obejmuje również wzrosty.

Zadeklarowane konflikty interesów są częścią lektury. Dwóch autorów badania skóry było dyrektorami start-upu biotechnologicznego działającego w obszarze NAD; pierwszy autor badania osocza był związany z firmą sprzedającą interwencje wydłużające życie. Żaden z tych faktów nie unieważnia pomiaru, a oba zostały ujawnione przez autorów. Są to powody, by oczekiwać niezależnej replikacji, a nie by odrzucać dane.

Dlaczego badania nad NAD nie zgadzają się ze sobą

Najpoważniejsze wyzwanie dla prostej narracji przyniosło śledzenie izotopowe, a nie lepsza metoda oznaczania stężeń. McReynolds i współpracownicy podawali we wlewie znakowane prekursory młodym i starym myszom i śledzili syntezę NAD w tkankach za pomocą spektrometrii mas. Cztery ustalenia jednocześnie podważyły standardową narrację.

Deplecja NAD+ w tkankach u starych myszy była umiarkowana, z medianą spadku wynoszącą około 30% – nie załamanie sugerowane przez frazę „spadek NAD+”.
Stężenie krążących prekursorów NAD+ nie uległo istotnym zmianom, a śledzenie wykazało niezaburzoną syntezę nikotynamidu z tryptofanu.
W większości tkanek obrót mniejszej puli NAD+ u starych zwierząt był nieco szybszy, więc bezwzględny przepływ biosyntezy NAD+ został utrzymany. Produkcja nie zawodziła.
Ograniczenie kaloryczne częściowo łagodziło zależny od wieku spadek przez zmniejszenie zużycia, natomiast ostry stres zapalny wywołany lipopolisacharydem obniżał NAD+ przez upośledzenie syntezy zarówno u młodych, jak i u starych zwierząt.

Ich wniosek jest taki, że spadek stężenia NAD wraz z normalnym starzeniem się jest stosunkowo subtelny i występuje pomimo utrzymanej produkcji, najprawdopodobniej dlatego, że enzymy zużywające są bardziej aktywne. Niższe stężenie przy niezmienionym przepływie to inne stwierdzenie fizjologiczne niż niewydolna ścieżka syntezy, i nie można ich odróżnić za pomocą pojedynczego pomiaru w jednym punkcie czasowym.

Towarzyszący przegląd tej samej grupy wprost przedstawia nierozwiązane problemy: wiele aspektów metabolizmu NAD+ pozostaje słabo poznanych, a dane od ludzi są ograniczone; zmiany składu komórek lub tkanek z wiekiem same mogą przesuwać zbiorczy odczyt NAD+; brakuje też narzędzi do określania zawartości NAD+ w konkretnych komórkach i przedziałach subkomórkowych oraz jakiejkolwiek wiedzy o progu, przy którym ubytek wywołuje skutki fizjologiczne w danej tkance. Bez znajomości progu nie da się orzec, czy różnica 30% jest istotna, czy błaha.

Dlaczego sposób postępowania z próbką i przedział decydują o liczbie

Pod każdą z tych wartości kryją się trzy ograniczenia strukturalne.

Przedział. Metabolity NAD w osoczu są pozakomórkowe. Badanie Clementa wyraźnie przedstawia swój wynik jako metabolom osoczowy NAD+, a jego autorzy opisują związane z wiekiem zmiany w tej zewnątrzkomórkowej puli. Traktowanie wartości osocza jako odczytu wewnątrzkomórkowego NAD w wątrobie lub neuronach jest wnioskiem, a nie pomiarem.

Uśrednianie. Ekstrakt całotkankowy uśrednia pule cytosolowe, mitochondrialne i jądrowe, które są regulowane oddzielnie, oraz uśrednia wartości dla każdego typu komórki obecnego w biopsji. Związana z wiekiem zmiana składu komórek w biopsji przesunie tę średnią bez zmiany pojedynczej komórki.

Chemia analityczna. NAD+ i NADH różnią się trwałością i są wrażliwe na warunki ekstrakcji, a formy zredukowane łatwo ulegają utracie. Dlatego celowane podejście oparte na spektrometrii mas zastąpiło detekcję UV i dlatego porównywanie bezwzględnych stężeń między badaniami, mierzonych w różnych laboratoriach z różnymi protokołami ekstrakcji, pozostaje zawodne.

CD38, apigenina i rola wzorców analitycznych

Jeśli to zużycie, a nie produkcja, napędza spadek, interesującymi celami stają się enzymy zużywające. Escande i współpracownicy, opisując CD38 – który ich grupa wcześniej zidentyfikowała jako główną NAD+azę u ssaków – scharakteryzowali dwa flawonoidy jako inhibitory CD38: kwercetynę i apigeninę. W ich eksperymentach farmakologiczne zahamowanie CD38 podnosiło poziom wewnątrzkomórkowego NAD+; traktowanie hodowli komórkowych apigeniną zmniejszało globalną acetylację białek oraz acetylację p53 i RelA-p65, a podanie apigeniny otyłym myszom zwiększało poziom NAD+, zmniejszało globalną acetylację białek i zmieniało kilka parametrów homeostazy glukozy i lipidów.

Praca ta dotyczy hodowli komórkowych i myszy. Wskazuje cel molekularny i narzędzie chemiczne, a nie efekt u ludzi, a autorzy przedstawiają ją jako wskazanie CD38 jako celu farmakologicznego, a nie jako gotową interwencję.

Chemia ma znaczenie dla każdego, kto powtarza takie eksperymenty. Apigenina to 5,7-dihydroksy-2-(4-hydroksyfenylo)-4H-chromen-4-on, PubChem CID 5280443, wzór sumaryczny C15H10O5, masa cząsteczkowa 270,24 g/mol, CAS 520-36-5. Należy do dużej rodziny blisko spokrewnionych flawonów, które różnią się pojedynczą grupą hydroksylową lub metoksylową i współwystępują w ekstraktach roślinnych, dlatego stałą inhibicji da się zinterpretować tylko wtedy, gdy badanym materiałem jest scharakteryzowany wzorzec analityczny z udokumentowaną tożsamością i czystością, a nie frakcja botaniczna o nominalnym składzie.

Często zadawane pytania

Jak mierzy się poziom NAD w tkance ludzkiej?

Na trzy sposoby, każdy dotyczący innego przedziału. Biochemiczne oznaczenia w materiale biopsyjnym dają zawartość w całej tkance, jak w badaniu ludzkiej skóry z 2012 roku. Celowana chromatografia cieczowa sprzężona z tandemową spektrometrią mas rozdziela poszczególne metabolity w osoczu lub ekstraktach tkankowych. Spektroskopia rezonansu magnetycznego fosforu-31 mierzy NAD+ i NADH nieinwazyjnie w nienaruszonych narządach, jak dotąd głównie w mózgu.

Czy można mierzyć stężenie NAD w żywym ludzkim mózgu?

Tak. W badaniu z 2015 roku opublikowanym w Proceedings of the National Academy of Sciences wykorzystano wysokopolową spektroskopię rezonansu magnetycznego fosforu-31 do ilościowego określenia wewnątrzkomórkowej zawartości NAD+ i NADH oraz stanu redoks NAD+/NADH w nienaruszonym ludzkim mózgu. U zdrowych ochotników odnotowano zależny od wieku wzrost poziomu NADH przy jednoczesnym spadku NAD+, całkowitego NAD i potencjału redoks.

Jaka jest różnica między stężeniem NAD a przepływem NAD?

Stężenie to wielkość puli w danej chwili; przepływ to szybkość, z jaką pula jest syntetyzowana i zużywana. Pula może się kurczyć przy niezmienionym przepływie, jeśli zarówno synteza, jak i zużycie wzrastają. Śledzenie izotopowe u starych myszy wykazało stężenie NAD+ w tkankach niższe o około 30% przy zachowanym bezwzględnym przepływie biosyntezy – różnicę niewidoczną dla oznaczeń stężenia.

O ile spada poziom NAD wraz z wiekiem u myszy?

W badaniu izotopowym przeprowadzonym na wielu tkankach starych myszy mediana spadku poziomu NAD+ wyniosła około 30%. Autorzy opisują ten spadek jako stosunkowo subtelny, zauważają, że krążące prekursory nie uległy znaczącym zmianom, i przypisują niższe stężenie raczej większej aktywności enzymów zużywających NAD+ niż upośledzonej syntezie.

Dlaczego badania nad NAD dają rozbieżne wyniki?

Ponieważ mierzą one różne przedziały różnymi instrumentami. Osocze, biopsja skóry i spektroskopia mózgu in vivo nie są wymiennymi odczytami, protokoły ekstrakcji różnią się między laboratoriami, a wartości dla całej tkanki uśredniają pule subkomórkowe i typy komórek. W tej dziedzinie brakuje też określonego progu, poniżej którego niedobór ma konsekwencje fizjologiczne, więc ta sama liczba uzasadnia przeciwstawne interpretacje.

Czy poziom NAD w osoczu jest dobrym markerem poziomu NAD w tkankach?

Nie zostało to ustalone. Metabolom NAD w osoczu jest pulą pozakomórkową, a badanie, które scharakteryzowało go w różnych grupach wiekowych, wykazało, że niektóre metabolity spadały, inne rosły, a kilka pozostawało bez zmian. Wnioskowanie o wewnątrzkomórkowym stanie NAD w wątrobie, mięśniach lub mózgu na podstawie wartości w osoczu jest założeniem i żadna opublikowana kalibracja go nie potwierdza.

Co ma wspólnego CD38 ze spadkiem poziomu NAD?

CD38 to zużywająca NAD+ glikohydrolaza, opisana przez Chiniego i współpracowników jako główna NAD+aza u ssaków. Ponieważ śledzenie izotopowe wskazuje, że przyczyną związanego z wiekiem spadku jest zwiększone zużycie, a nie upośledzona synteza, w centrum zainteresowania mechanistycznego znalazły się enzymy zużywające, takie jak CD38 i PARP. W tym kontekście apigeninę i kwercetynę scharakteryzowano jako inhibitory CD38.

Bibliografia

Tylko do celów badawczych. Nonsensia dostarcza wzorce analityczne do zastosowań laboratoryjnych i badawczych. Niniejszy artykuł jest publikowany w celach naukowych i edukacyjnych. Nie stanowi on porady medycznej, nie opisuje żadnego zastosowania u ludzi, a nic w nim zawartego nie powinno być odczytywane jako zalecenie podania jakiejkolwiek substancji osobie lub zwierzęciu.

Kategorie: Nauka o długowieczności

Ten artykuł jest częścią naszego przewodnika: Biologia starzenia: cechy charakterystyczne, chemia i co potwierdzają dowody.

Omawiana w tym artykule substancja jest dostępna jako wzorzec analityczny: Apigenina ≥99% – wzorzec analityczny, 1000 mg | CAS 520-36-5.

Spadek poziomu NAD+ wraz z wiekiem: dowody i ograniczenia