Ce înseamnă de fapt puritatea HPLC de 99 la sută?

O cromatogramă este o reprezentare a semnalului detectorului în funcție de timp. Nu este o reprezentare a masei în funcție de timp. Aproape orice neînțelegere privind puritatea se află în distanța dintre aceste două propoziții.

Așadar, ce înseamnă o puritate HPLC de 99 la sută atunci când apare pe un certificat? În majoritatea cazurilor înseamnă exact un singur lucru: că 99 la sută din aria totală integrată a picurilor dintr-o singură cromatogramă, înregistrată cu un singur detector la o singură lungime de undă, a aparținut unui singur pic. Acesta este un raport de arii. Nu este, în sine, o afirmație despre câte miligrame din flacon reprezintă compusul pe care l-ați comandat.

Cele două valori pot diverge în ambele direcții, iar nimic de pe cromatogramă nu indică în ce sens.

Ce înseamnă și ce nu înseamnă o puritate HPLC de 99 la sută

Tehnica din spatele valorii este normalizarea ariilor. Fiecare pic din analiză este integrat, ariile sunt însumate, iar fiecare pic este raportat ca procent din această sumă. Nu se cântărește niciun standard extern și nu se construiește nicio curbă de calibrare. Metoda este rapidă, nu necesită o probă autentică de impuritate și funcționează pentru compuși pe care nu i-a izolat nimeni.

Ea se bazează însă și pe trei ipoteze tacite:

tot ce este prezent în probă părăsește coloana în timpul analizei;
tot ce părăsește coloana produce un semnal în detector;
mase egale de compuși diferiți produc semnale egale.

Toate trei sunt aproximări. A treia eșuează cel mai des și eșuează fără să se observe.

De ce aria unui pic este un semnal al detectorului, nu o cantitate de substanță

Un detector în ultraviolet măsoară absorbanța la o lungime de undă aleasă. Absorbanța depinde de structura electronică a moleculei care trece prin celula de flux. Doi compuși prezenți în concentrații identice vor da arii de pic identice numai dacă absorb identic la acea lungime de undă, ceea ce este o coincidență, nu o regulă.

Raportul dintre ele se numește factorul de răspuns relativ (RRF). Un exemplu publicat face ordinul de mărime concret. Într-un studiu de impurități, cu metodă indicatoare de stabilitate, al antimalaricului lumefantrină, derivatul desbenzilceto (DBK) a fost cuantificat față de lumefantrină la 266 nm, iar factorul său de răspuns relativ a fost determinat experimental ca fiind 2,87 – raportul dintre aria picului compusului și aria picului lumefantrinei la aceeași concentrație. O masă egală de DBK generează așadar un semnal de aproape trei ori mai mare. Citită ca procent brut de arie, această impuritate este supraestimată de aproximativ trei ori.

Autoritățile de reglementare tratează aceasta ca pe o problemă cunoscută și delimitată. Ghidul ICH privind validarea procedurilor analitice, Q2(R2), adoptat în noiembrie 2023, prevede că, atunci când un analit are un răspuns diferit de cel al materialului de referință – de exemplu o absorbanță UV specifică diferită – factorii de răspuns relativi trebuie calculați din raportul adecvat al răspunsurilor și că dacă factorul de răspuns relativ se află în afara intervalului 0,8-1.2, atunci trebuie aplicat un factor de corecție. Același pasaj adaugă o excepție grăitoare: dacă o impuritate sau un produs de degradare este supraestimat, poate fi acceptabil să nu se aplice corecția. Asimetria este deliberată. Supraestimarea unei impurități este conservatoare; subestimarea ei nu este.

Ce nu vă arată niciodată cromatograma

Normalizarea ariilor poate repartiza doar ceea ce a văzut detectorul. Mai multe clase întregi de materiale se află, prin construcție, în afara acestui set.

Compuși fără cromofor. Atunci când o substanță activă sau unele dintre impuritățile sale nu au un cromofor care absoarbe în UV, acestea nu vor fi detectate într-o analiză HPLC de rutină care utilizează numai un detector UV și trebuie utilizată o schemă de detecție alternativă.
Solvenți reziduali. ICH Q3C(R9) afirmă explicit că solvenții reziduali se determină de regulă prin tehnici cromatografice precum gaz-cromatografia. Ei fac obiectul unui test separat, de obicei prin GC headspace, și nu reprezintă un pic în cromatograma dumneavoastră de lichide.
Apă. Titrarea Karl Fischer este calea standard pentru determinarea conținutului de apă în substanțele organice. Apa este în general invizibilă pentru un detector UV și nu face parte dintr-o valoare de procent de arie.
Impurități elementale. ICH Q3D(R2) cere ca, în lipsa unei justificări contrare, testul să fie specific pentru fiecare impuritate elementală identificată pentru control, utilizând proceduri farmacopeice sau proceduri alternative adecvate. Reziduurile de catalizator și metalele se măsoară prin tehnici precum ICP-MS, niciodată prin integrarea picurilor.
Material care nu eluează niciodată. Substanțele puternic reținute sau insolubile nu contribuie deloc la arie și, prin urmare, nu pot apărea la numitor.

Un rezultat de 99,5 la sută arie este, prin urmare, o afirmație despre fracțiunea probei activă în UV și eluată de pe coloană. Tot restul trebuie stabilit printr-o altă măsurătoare sau nu poate fi stabilit deloc.

Cum încadrează ICH Q3A valoarea pe care o citiți

Vocabularul utilizat pe majoritatea certificatelor își are originea în ICH Q3A(R2), Impurities in New Drug Substances, a cărui versiune actuală Step 4 este datată 25 octombrie 2006. Acesta definește trei praguri, legate de doza zilnică maximă a unui medicament: un prag de raportare peste care o impuritate trebuie raportată, un prag de identificare peste care aceasta trebuie identificată structural și un prag de calificare peste care trebuie stabilită siguranța sa biologică. Pentru o doză zilnică maximă de 2 g/zi sau mai puțin, ghidul le stabilește la 0,05 la sută, 0,10 la sută (sau un aport de 1,0 mg pe zi, oricare este mai mic) și 0,15 la sută (sau un aport de 1,0 mg pe zi, oricare este mai mic). Peste 2 g/zi, ele se înăspresc la 0,03, 0,05 și 0,05 la sută.

Două detalii din Q3A merită citite cu atenție. În primul rând, ghidul acceptă ca substanța activă însăși să fie utilizată ca standard pentru estimarea nivelurilor de impurități și că, acolo unde factorii de răspuns nu sunt apropiați, acest lucru rămâne adecvat cu condiția să se aplice un factor de corecție sau ca impuritățile să fie de fapt supraestimate. În al doilea rând, arată că criteriile de acceptare și procedurile de estimare a impurităților se poate baza pe ipoteze analitice (de exemplu, răspuns echivalent al detectorului), și că aceste ipoteze trebuie discutate în cerere. Ghidul nu pretinde că procentul de arie este egal cu procentul de masă. Vă cere să declarați explicit că presupuneți acest lucru.

Aceste praguri se aplică medicamentelor și sunt raportate la doza zilnică, așa că nu se transferă direct asupra unui reactiv de catalog. Ele rămân însă cel mai util vocabular comun pentru a discuta ce afirmă un certificat.

Normalizarea ariilor versus bilanțul masic: două întrebări diferite

Atunci când o valoare de puritate trebuie să aibă greutate metrologică, normalizarea ariilor este înlocuită cu abordarea bilanțului masic: fiecare clasă de impurități este măsurată printr-o tehnică adecvată, iar totalul se scade din 100 la sută. Un studiu din 2024 de atribuire a purității fosfatului de tripropil descrie metoda ca una indirectă, care măsoară separat conținutul diferitelor tipuri de impurități și le scade din 100 la sută, acoperind impuritățile organice înrudite structural, apa, solvenții organici reziduali și impuritățile anorganice – în acea lucrare prin cromatografie, titrare Karl Fischer, GC headspace cu detecție prin ionizare în flacără și, respectiv, ICP-MS.

Bilanțul masic are propria slăbiciune: poate scădea doar impuritățile pe care cineva s-a gândit să le caute. Același studiu îl asociază cu NMR cantitativ, deoarece qNMR abordează limitarea că bilanțul masic s-ar putea să nu identifice toate impuritățile.

Abordare	Întrebarea la care răspunde	Ipoteza cheie	Tehnici tipice
Normalizarea ariilor	Ce fracțiune din semnalul detectat reprezintă picul principal?	Răspuns egal al detectorului pe unitatea de masă	HPLC-UV, HPLC-DAD, GC-FID
Dozare față de un standard	Câtă substanță de analizat se află în probă raportat la o referință?	Puritatea proprie a materialului de referință este cunoscută	HPLC cu standard extern sau intern
Bilanț masic	Ce reprezintă tot ceea ce nu este analitul?	Au fost căutate toate clasele de impurități	HPLC, Karl Fischer, GC-FID headspace, ICP-MS
NMR cantitativ	Ce fracțiune masică reprezintă analitul, măsurată direct?	Semnale curate, integrabile și atribuibile	qNMR 1H sau 31P față de un standard certificat

Cum citiți un certificat de analiză fără a-i atribui mai mult decât spune

Cinci întrebări separă o valoare de puritate pe care o puteți utiliza de una pe care o puteți doar cita.

Metoda și detectorul. HPLC-UV, HPLC-CAD, GC-FID și qNMR răspund la întrebări diferite și nu sunt interschimbabile.
Lungime de undă. Un procent înregistrat la 254 nm și unul înregistrat la 210 nm pot descrie același flacon și pot fi în dezacord.
Procent de arie sau dozare. Un procent de arie nu are o referință externă; o dozare are. Numai una dintre ele este trasabilă la o masă.
Factorii de răspuns. Au fost determinați factorii RRF și au fost aplicați factori de corecție acolo unde aceștia s-au situat în afara intervalului 0,8-1.2?
Testele separate. Apa, solvenții reziduali și impuritățile elementale necesită fiecare propriul rând în document.

Două loturi pot indica ambele 99,5 la sută și pot diferi prin ceea ce conțin restul de 0,5 la sută, cât din acesta există cu adevărat și cât nu a intrat niciodată în cromatogramă. Pentru materialul utilizat ca referință analitică în lucrul de laborator, această diferență este însuși rostul documentației.

Întrebări frecvente

Ce înseamnă de fapt o puritate de 99 la sută prin HPLC?

De regulă înseamnă că 99 la sută din aria totală integrată a picurilor dintr-o cromatogramă a aparținut picului principal. Este un raport al semnalului detectorului, nu al masei. Se aplică numai substanțelor care au eluat de pe coloană și au produs un răspuns în detectorul utilizat, la lungimea de undă utilizată.

Este procentul de arie HPLC același lucru cu un rezultat de dozare?

Nu. Un procent de arie este intern unei singure cromatograme și nu utilizează nicio referință externă. O dozare compară răspunsul analitului cu un material de referință cântărit, cu conținut cunoscut, ceea ce o face trasabilă la masă. Cele două valori sunt adesea diferite pentru aceeași probă și răspund la întrebări diferite.

Include o valoare de puritate HPLC apa și solvenții reziduali?

În general, nu. Apa se determină prin titrare Karl Fischer, iar ICH Q3C(R9) menționează că solvenții reziduali se determină de regulă prin tehnici cromatografice precum gaz-cromatografia. Niciuna nu apare ca pic integrat într-o analiză HPLC-UV de rutină în fază inversă, așa că niciuna nu este scăzută într-o valoare de procent de arie.

Ce este un prag de raportare în ICH Q3A?

ICH Q3A(R2) definește pragul de raportare ca o limită peste care o impuritate trebuie raportată. Pentru o doză zilnică maximă de 2 g/zi sau mai puțin, acesta este stabilit la 0,05 la sută; peste 2 g/zi se înăsprește la 0,03 la sută. Ghidul cere, de asemenea, ca limita de cuantificare a procedurii să nu fie mai mare decât acest prag.

De ce pot avea două loturi cu aceeași puritate profiluri de impurități diferite?

Pentru că procentul de arie descrie un total, nu o compoziție. Sinteze, solvenți și istorii de depozitare diferite generează substanțe înrudite diferite, iar fiecare dintre acestea are propriul răspuns în detector. Aceeași valoare principală poate corespunde, prin urmare, unor substanțe diferite prezente în cantități reale diferite.

Poate HPLC să detecteze fiecare impuritate dintr-o probă?

Nu. Compușii fără un cromofor care absoarbe în UV nu sunt văzuți de un detector UV, impuritățile anorganice și elementale necesită proceduri specifice elementelor conform ICH Q3D(R2), solvenții volatili sunt tratați prin gaz-cromatografie, iar orice nu eluează nu contribuie cu niciun pic. Caracterizarea completă necesită mai multe metode ortogonale.

Referințe

Numai pentru cercetare. Nonsensia furnizează standarde de referință analitice pentru aplicații de laborator și de cercetare. Acest articol este publicat în scopuri științifice și educaționale. Nu constituie un sfat medical, nu descrie nicio utilizare la om și nimic din cuprinsul său nu trebuie interpretat ca o recomandare de a administra vreo substanță unei persoane sau unui animal.

Categorie: Analytical Methods

Acest articol face parte din ghidul nostru despre Identitate și puritate: ghid complet al metodelor analitice pentru molecule mici.

Ce măsoară de fapt o valoare de puritate HPLC