Co tak naprawdę oznacza 99% czystości według HPLC?

Chromatogram to wykres sygnału detektora w funkcji czasu. Nie jest to wykres masy w funkcji czasu. Prawie każde nieporozumienie dotyczące czystości tkwi w luce między tymi dwoma zdaniami.

Co zatem oznacza czystość HPLC na poziomie 99%, gdy widnieje na świadectwie analizy? W większości przypadków oznacza dokładnie jedno: że 99% całkowitej scałkowanej powierzchni pików w pojedynczym chromatogramie, zarejestrowanym jednym detektorem przy jednej długości fali, przypadało na jeden pik. Jest to stosunek powierzchni. Sam w sobie nie mówi, ile miligramów zawartości fiolki stanowi zamówiony związek.

Dwie wartości mogą się różnić w obu kierunkach i nic na chromatogramie nie mówi, w którą stronę.

Co oznacza, a czego nie oznacza 99 procent czystości HPLC

Technika stojąca za tą wartością to normalizacja powierzchni. Każdy pik w analizie jest całkowany, powierzchnie są sumowane, a każdy pik podaje się jako procent tej sumy. Nie odważa się żadnego wzorca zewnętrznego ani nie sporządza krzywej kalibracyjnej. Metoda jest szybka, nie wymaga autentycznej próbki zanieczyszczenia i sprawdza się w przypadku związków, których nikt nie wyizolował.

Opiera się również na trzech milczących założeniach:

wszystko, co jest obecne w próbce, opuszcza kolumnę podczas analizy;
wszystko, co opuszcza kolumnę, daje sygnał w detektorze;
równe masy różnych związków dają równy sygnał.

Wszystkie trzy są przybliżeniami. Trzecie z nich zawodzi najczęściej, i to bezgłośnie.

Dlaczego powierzchnia piku jest sygnałem detektora, a nie ilością materii

Detektor UV mierzy absorbancję przy wybranej długości fali. Absorbancja zależy od struktury elektronowej cząsteczki przechodzącej przez komórkę przepływową. Dwa związki obecne w identycznych stężeniach dadzą identyczne powierzchnie pików tylko wtedy, gdy absorbują identycznie przy tej długości fali, co jest raczej zbiegiem okoliczności niż regułą.

Stosunek tych sygnałów ma swoją nazwę: względny współczynnik odpowiedzi (RRF). Jeden opublikowany przykład czyni tę skalę konkretną. W badaniu zanieczyszczeń wskazującym na stabilność leku przeciwmalarycznego lumefantryny pochodną desbenzyloketową (DBK) oznaczono ilościowo względem lumefantryny przy 266 nm, a jej względny współczynnik odpowiedzi wyznaczono doświadczalnie jako 2,87 – stosunek powierzchni piku związku do powierzchni piku lumefantryny przy tym samym stężeniu. Równa masa DBK daje zatem blisko trzykrotnie większy sygnał. Odczytane jako surowy procent powierzchni, to zanieczyszczenie jest zawyżone mniej więcej trzykrotnie.

Organy regulacyjne traktują to jako znany problem o określonych granicach. Wytyczna ICH dotycząca walidacji procedur analitycznych, Q2(R2), przyjęta w listopadzie 2023 r., stwierdza, że gdy analit daje inną odpowiedź niż materiał odniesienia – na przykład ma inną absorbancję właściwą w UV – względne współczynniki odpowiedzi należy obliczyć z odpowiedniego stosunku odpowiedzi, oraz że jeśli względny współczynnik odpowiedzi jest poza zakresem 0,8-1,2, to należy zastosować współczynnik korygujący. Ten sam fragment zawiera wymowny wyjątek: jeśli zanieczyszczenie lub produkt rozkładu jest przeszacowane, niestosowanie korekty może być dopuszczalne. Ta asymetria jest zamierzona. Przeszacowanie zanieczyszczenia jest podejściem ostrożnym; jego niedoszacowanie – nie.

Czego chromatogram nigdy nie pokaże

Normalizacja powierzchni może jedynie rozdzielić to, co zarejestrował detektor. Kilka całych klas materiału z definicji pozostaje poza tym zbiorem.

Związki bez chromoforu. Jeśli substancja czynna lub niektóre z jej zanieczyszczeń nie posiadają chromoforu pochłaniającego promieniowanie UV, nie będą wykryte w rutynowej analizie HPLC przy użyciu samego detektora UV i należy zastosować alternatywny schemat detekcji.
Pozostałości rozpuszczalników. ICH Q3C(R9) wyraźnie stwierdza, że pozostałości rozpuszczalników są zazwyczaj oznaczane za pomocą technik chromatograficznych, takich jak chromatografia gazowa. Są one oddzielnym testem, zwykle przeprowadzanym metodą GC z fazy nadpowierzchniowej, a nie pikiem w chromatogramie cieczowym.
Woda. Miareczkowanie Karla Fischera jest standardową metodą oznaczania zawartości wody w substancjach organicznych. Woda jest na ogół niewidoczna dla detektora UV i nie jest uwzględniana w wyniku procentu powierzchni.
Zanieczyszczenia pierwiastkowe. ICH Q3D(R2) wymaga, aby – o ile nie uzasadniono inaczej – badanie było specyficzne dla każdego zanieczyszczenia pierwiastkowego wskazanego do kontroli, z użyciem procedur farmakopealnych lub odpowiednich procedur alternatywnych. Pozostałości katalizatorów i metale mierzy się technikami takimi jak ICP-MS, nigdy przez całkowanie pików.
Materiał, który nigdy nie eluuje. Materiał silnie zatrzymywany lub nierozpuszczalny nie wnosi w ogóle żadnej powierzchni i dlatego nie może pojawić się w mianowniku.

Wynik 99,5% powierzchni jest zatem stwierdzeniem dotyczącym frakcji próbki aktywnej w UV i eluowanej z kolumny. Wszystko inne trzeba ustalić innym pomiarem – albo nie ustala się tego wcale.

Jak ICH Q3A określa liczbę, którą czytasz

Słownictwo używane na większości świadectw analizy pochodzi z ICH Q3A(R2), Impurities in New Drug Substances, której obecna wersja Step 4 nosi datę 25 października 2006 r. Określa ona trzy progi powiązane z maksymalną dawką dobową produktu leczniczego: próg raportowania, powyżej którego zanieczyszczenie należy raportować, próg identyfikacji, powyżej którego należy je zidentyfikować strukturalnie, oraz próg kwalifikacji, powyżej którego należy ustalić jego bezpieczeństwo biologiczne. Dla maksymalnej dawki dobowej wynoszącej 2 g/dzień lub mniej wytyczna ustala je na poziomie 0,05%, 0,10% (lub 1,0 mg przyjmowanego dziennie, w zależności od tego, która wartość jest niższa) i 0,15% (lub 1,0 mg przyjmowanego dziennie, w zależności od tego, która wartość jest niższa). Powyżej 2 g/dzień progi zaostrzają się do 0,03%, 0,05% i 0,05%.

Dwa szczegóły w Q3A warto przeczytać uważnie. Po pierwsze, wytyczna dopuszcza użycie samej substancji leczniczej jako wzorca do oszacowania poziomów zanieczyszczeń i uznaje, że gdy współczynniki odpowiedzi nie są zbliżone, pozostaje to właściwe, o ile zastosuje się współczynnik korygujący albo zanieczyszczenia są faktycznie przeszacowane. Po drugie, stwierdza ona, że kryteria akceptacji i procedury szacowania zanieczyszczeń mogą opierać się na założeniach analitycznych (np. równoważna odpowiedź detektora), a założenia te należy omówić we wniosku. Wytyczna nie udaje, że procent powierzchni równa się procentowi masowemu. Wymaga wyraźnego stwierdzenia, że takie założenie się przyjmuje.

Progi te dotyczą produktów leczniczych i są powiązane z dawką dobową, więc nie przenoszą się bezpośrednio na odczynnik katalogowy. Pozostają jednak najbardziej użytecznym wspólnym słownikiem do omawiania tego, co deklaruje świadectwo analizy.

Normalizacja powierzchni a bilans masy: dwa różne pytania

Gdy wartość czystości ma mieć znaczenie metrologiczne, zamiast normalizacji powierzchni stosuje się bilans masy – każdą klasę zanieczyszczeń mierzy się odpowiednią dla niej techniką, a sumę odejmuje się od 100 procent. Badanie z 2024 roku dotyczące wyznaczania czystości tripropylofosforanu opisuje tę metodę jako pośrednią, polegającą na osobnym pomiarze zawartości różnych typów zanieczyszczeń i odjęciu ich od 100 procent; obejmuje ona strukturalnie pokrewne zanieczyszczenia organiczne, wodę, pozostałości rozpuszczalników organicznych oraz zanieczyszczenia nieorganiczne – w tej pracy oznaczane odpowiednio chromatografią, miareczkowaniem Karla Fischera, headspace GC z detektorem płomieniowo-jonizacyjnym oraz ICP-MS.

Bilans masy ma własną słabość: pozwala odjąć wyłącznie te zanieczyszczenia, których ktoś postanowił szukać. To samo badanie łączy go z ilościowym NMR, ponieważ qNMR odpowiada na ograniczenie polegające na tym, że bilans masy może nie wykryć wszystkich zanieczyszczeń.

Podejście	Pytanie, na które odpowiada	Kluczowe założenie	Typowe techniki
Normalizacja powierzchni	Jaka część wykrytego sygnału to główny pik?	Jednakowa odpowiedź detektora na jednostkę masy	HPLC-UV, HPLC-DAD, GC-FID
Oznaczanie wobec wzorca	Ile analitu znajduje się w próbce w porównaniu do wzorca?	Czystość wzorca analitycznego jest znana	HPLC z wzorcem zewnętrznym lub wewnętrznym
Bilans masy	Czym jest wszystko, co nie jest analitem?	Poszukiwano wszystkich klas zanieczyszczeń	HPLC, metoda Karla Fischera, headspace GC-FID, ICP-MS
NMR ilościowy	Jaki jest ułamek masowy analitu, mierzony bezpośrednio?	Czyste, całkowalne i przypisywalne sygnały	qNMR 1H lub 31P względem certyfikowanego wzorca analitycznego

Odczytywanie świadectwa analizy bez nadinterpretacji

Pięć pytań oddziela wartość czystości, której możesz użyć, od takiej, którą możesz tylko zacytować.

Metoda i detektor. HPLC-UV, HPLC-CAD, GC-FID i qNMR odpowiadają na różne pytania i nie są wymienne.
Długość fali. Procent zapisany przy 254 nm i procent zapisany przy 210 nm mogą opisywać tę samą fiolkę i się różnić.
Procent powierzchni lub oznaczanie zawartości. Procent powierzchni nie ma zewnętrznego odniesienia; wynik oznaczenia zawartości je ma. Tylko jeden z nich zapewnia spójność pomiarową z masą.
Współczynniki odpowiedzi. Czy wyznaczono RRF i czy zastosowano współczynniki korygujące tam, gdzie wartości wykraczały poza zakres 0,8-1,2?
Odrębne badania. Woda, pozostałości rozpuszczalników i zanieczyszczenia pierwiastkowe wymagają osobnych pozycji w dokumencie.

Dwie partie mogą obie wykazywać 99,5% i różnić się tym, co zawiera pozostałe 0,5%, jak dużo tego faktycznie jest oraz jak wiele nigdy nie znalazło się na chromatogramie. Dla materiału używanego jako wzorzec analityczny w pracy laboratoryjnej, ta różnica jest całym sednem dokumentacji.

Często zadawane pytania

Co właściwie oznacza 99% czystości według HPLC?

Zwykle oznacza to, że 99 procent całkowitej scałkowanej powierzchni pików w jednym chromatogramie przypadało na pik główny. Jest to stosunek sygnałów detektora, a nie mas. Dotyczy tylko substancji, które zostały wymyte z kolumny i dały odpowiedź w użytym detektorze, przy użytej długości fali.

Czy procent powierzchni w HPLC jest tym samym co wynik oznaczenia zawartości?

Nie. Procent powierzchni jest wielkością wewnętrzną pojedynczego chromatogramu i nie korzysta z zewnętrznego odniesienia. Oznaczenie zawartości porównuje odpowiedź analitu z odważonym materiałem odniesienia o znanej zawartości, co zapewnia spójność pomiarową z masą. Te dwie wartości często różnią się dla tej samej próbki i odpowiadają na różne pytania.

Czy wynik czystości HPLC uwzględnia wodę i pozostałości rozpuszczalników?

Na ogół nie. Wodę oznacza się metodą miareczkowania Karla Fischera, a ICH Q3C(R9) zaznacza, że pozostałości rozpuszczalników oznacza się zwykle technikami chromatograficznymi, takimi jak chromatografia gazowa. Żadne z nich nie pojawia się jako scałkowany pik w rutynowej analizie HPLC-UV w układzie faz odwróconych, więc żadne nie jest odejmowane w wyniku procentu powierzchni.

Co to jest próg raportowania w ICH Q3A?

ICH Q3A(R2) określa próg raportowania jako limit, powyżej którego zanieczyszczenie powinno być zgłoszone. Dla maksymalnej dziennej dawki wynoszącej 2 g/dzień lub mniej ustalono go na poziomie 0,05%; powyżej 2 g/dzień próg ten zaostrza się do 0,03%. Wytyczna wymaga również, aby granica oznaczalności procedury nie była wyższa niż ten próg.

Dlaczego dwie partie o tym samym stopniu czystości mogą mieć różne profile zanieczyszczeń?

Ponieważ procent powierzchni opisuje sumę, a nie skład. Różne syntezy, rozpuszczalniki i historie przechowywania dają różne substancje pokrewne, a każda z nich ma własną odpowiedź detektora. Ta sama wartość podawana na pierwszym planie może zatem odpowiadać różnym substancjom obecnym w różnych rzeczywistych ilościach.

Czy HPLC może wykryć każde zanieczyszczenie w próbce?

Nie. Związki pozbawione chromoforu absorbującego UV nie są widoczne dla detektora UV, zanieczyszczenia nieorganiczne i pierwiastkowe wymagają procedur specyficznych dla pierwiastków zgodnie z ICH Q3D(R2), lotne rozpuszczalniki są oznaczane metodą chromatografii gazowej, a wszystko, co nie eluuje, nie wnosi żadnego piku. Pełna charakterystyka wymaga kilku metod ortogonalnych.

Bibliografia

Tylko do celów badawczych. Nonsensia dostarcza wzorce analityczne do zastosowań laboratoryjnych i badawczych. Niniejszy artykuł jest publikowany w celach naukowych i edukacyjnych. Nie stanowi on porady medycznej, nie opisuje żadnego zastosowania u ludzi, a nic w nim zawartego nie powinno być odczytywane jako zalecenie podania jakiejkolwiek substancji osobie lub zwierzęciu.

Kategorie: Metody analityczne

Ten artykuł jest częścią naszego przewodnika: Tożsamość i czystość: kompletny przewodnik po metodach analitycznych dla małych cząsteczek.

Co naprawdę mierzy wynik czystości HPLC