W 1996 roku laboratorium w Instytucie Farmakologii Rosyjskiej Akademii Nauk Medycznych zgłosiło obecność cyklicznego dipeptydu w tkance mózgowej szczura, przypisując mu wartość: 2,8 nmol na gram mokrej tkanki mózgowej, zmierzoną metodą chromatografii gazowej. Czternaście lat później to samo laboratorium opublikowało wartość 29,2 nmol na gram dla całego mózgu szczura. Obie liczby opisują tę samą cząsteczkę, cykloprolyloglicynę.
Dziesięciokrotna niezgodność w ramach jednego programu badawczego jest tutaj pierwszą rzeczą wartą uwagi. Drugą kwestią jest to, co cząsteczka ma wyjaśniać. Noopept to laboratoryjny skrót od estru etylowego N-fenyloacetylo-L-prolyloglicyny, a związane z nim twierdzenie dotyczy statusu proleku: ester jest rozkładany w organizmie, a to, co faktycznie dociera do tkanki nerwowej, to mniejszy cykliczny dipeptyd. Ten proponowany metabolit to cykloprolyloglicyna.
Co faktycznie zakłada hipoteza o cykloprolyloglicynie jako metabolicie noopeptu
PubChem wymienia związek macierzysty pod identyfikatorem 180496, ze wzorem sumarycznym C17H22N2O4, masą cząsteczkową 318,4 i nazwą systematyczną 2-[[(2S)-1-(2-fenyloacetylo)pirolidyno-2-karbonylo]amino]octan etylu. Ten rekord zawiera pojedynczy numer rejestrowy, 157115-85-0.
Proponowany metabolit jest mniejszy i znacznie bardziej polarny: wzór sumaryczny C7H10N2O2, masa cząsteczkowa 154,17, obliczony współczynnik podziału minus 0,6 i zero wiązań rotacyjnych. Obraz identyfikatorów jest tu mniej uporządkowany. PubChem przechowuje ten cykliczny dipeptyd w więcej niż jednym rekordzie: jednym z nieokreśloną stereochemią i drugim z określoną konfiguracją 8aS, przy czym rekord z określoną stereochemią ma dwa numery rejestrowe zamiast jednego. Pojedynczy numer CAS podawany dla tej cząsteczki jest wyborem spośród rekordów, których sam PubChem nie scala.
Propozycja proleku dzieli się na trzy twierdzenia, które utrzymują się lub upadają niezależnie: że cykloprolyloglicyna występuje naturalnie w tkance mózgowej, że ester macierzysty jest przekształcany w nią oraz że to metabolit, a nie związek macierzysty, odpowiada za farmakologię. Te trzy twierdzenia opierają się na różnych dowodach.
Jak po raz pierwszy wykryto cykloprolylglicynę w mózgu szczura
Raport z 1996 roku w FEBS Letters połączono wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC), chromatografię gazową oraz chromatografię ze spektrometrią mas w celu identyfikacji cyklicznego dipeptydu w mózgu szczura. Autorzy podali, że materiał syntetyczny wykazywał działanie przeciwamnestyczne w teście biernego unikania, i zasugerowali, że jego obecność w mózgu wskazuje na nieznany wcześniej szlak regulacji pamięci.
Praca o metabolizmie ukazała się w 1997 r. w European Journal of Drug Metabolism and Pharmacokinetics. Estru macierzystego nie wykryto w mózgu szczura godzinę po wstrzyknięciu dootrzewnowym, przy granicy wykrywalności zastosowanej metody HPLC. Trzy potencjalne produkty rozkładu, kwas fenylooctowy, prolyloglicynę i cykloprolyloglicynę, znaleziono w mózgach zwierząt, którym podano związek, a także w mózgach zwierząt kontrolnych, którym nic nie podano. Po podaniu związku macierzystego wzrósł, około 2,5-krotnie, jedynie poziom cyklicznego dipeptydu. Przemianę w obecności enzymów osocza i mózgu wykazano również in vitro.
Z tego eksperymentu wynikają dwie rzeczy i tylko dwie. Związek macierzysty pozostawał w tkance mózgowej poniżej granicy wykrywalności, a poziom jednego z jego możliwych produktów rozpadu wzrósł. Taki obraz pasuje do relacji prolek–metabolit. Pasuje jednak również do szybkiej eliminacji związku macierzystego, cyklizacji zachodzącej głównie w osoczu albo granicy wykrywalności wyższej niż obecne stężenie. Eksperyment nie rozróżnił tych wyjaśnień.
Odróżnienie estru macierzystego od jego cyklicznego produktu rozpadu w chromatogramie wymaga łącznie czasu retencji i masy, dlatego w pracach tego rodzaju jako odniesienie stosuje się scharakteryzowany wzorzec analityczny noopeptu i syntetyczny cykliczny dipeptyd o zadeklarowanej stereochemii.
Dlaczego zgłoszone stężenia w mózgu nie są zgodne
Badanie lokalizacyjne z 2010 roku z tego samego instytutu wykazało u szczurów nierównomierny rozkład w poszczególnych regionach mózgu: 29,2 nmol na gram w całym mózgu, 38,9 w korze i 126,4 w hipokampie. Około 60 procent peptydu znajdowało się we frakcji subkomórkowej jądrowej.
Zestaw tę wartość z podanymi w 1996 roku 2,8 nmol na gram, a rozbieżność okaże się rzędu wielkości. Chemia ekstrakcji, detektory i grupy zwierząt wpływają na bezwzględne stężenie w tkance. Teza jest jednak węższa: nie ma ustalonego endogennego stężenia tej cząsteczki i nie odnaleziono niezależnego powtórzenia żadnej z tych wartości.
Jest jeszcze jeden niuans analityczny. Cykliczne dipeptydy tej klasy, diketopiperazyny, nie występują wyłącznie w tkankach ssaków. Badanie kliniczne z 2018 roku w Nutrients zmierzono ten sam cykliczny dipeptyd glicyna-prolina w płynie mózgowo-rdzeniowym i stwierdzono, że cząsteczka była już obecna w preparacie z czarnej porzeczki podawanym uczestnikom. Związek występujący w materiale roślinnym może wnosić egzogenny wkład w stężenie w tkance, co komplikuje użycie słowa endogenny, ale go nie podważa.
Co zmierzono w eksperymentach z receptorami AMPA i TrkB
Argument mechanistyczny budowano powoli i w jednym miejscu. Artykuł z 2016 roku w Doklady Biochemistry and Biophysics doniesiono, że cyklopeptyd w stężeniu jednomikromolowym nasilał przezbłonowe prądy AMPA w komórkach Purkinjego móżdżku szczura, i opisano go jako endogenny dodatni modulator receptorów AMPA, wiążąc to z wcześniejszymi pracami nad czynnikiem neurotroficznym pochodzenia mózgowego w hodowli.
Przeprowadzono dwa badania blokady. W 2020 roku ta sama grupa zgłosiła, że DNQX, antagonista receptora AMPA, oraz K252a, inhibitor receptora Trk, każdy z osobna zapobiegały efektowi przeciwlękowemu u gryzoni. W 2022 roku zgłosili oni, że DNQX, niekonkurencyjny bloker GYKI 52466 oraz K252a każdy z osobna zapobiegały efektowi neuroprotekcyjnemu in vitro. Eksperymenty blokady mówią o konieczności, ale nie o wystarczalności: pokazują, że nienaruszona ścieżka AMPA i Trk jest wymagana, ale nie to, że peptyd wiąże się z którymkolwiek z tych receptorów. Nigdzie w serii nie podano stałej wiązania.
Oddzielne badanie z 2020 roku poszukiwało aktywności mitogennej w komórkach HEK293 i SH-SY5Y i nie wykazało takiej aktywności, raportując zamiast tego zmniejszenie liczby komórek we wczesnej apoptozie. Ten negatywny wynik został opublikowany otwarcie.
Jedno z ustaleń z 2022 roku nie mieści się wygodnie w prostym modelu proleku. Grupa badaczy z ośrodka Research Center of Neurology w Moskwie, pracująca na skrawkach hipokampa szczura, stwierdziła, że sam macierzysty dipeptyd zwiększał częstotliwość wyładowań interneuronów GABA-ergicznych, a alfa-bungarotoksyna i metylolikakonityna, obie selektywne wobec receptora nikotynowego acetylocholiny α7, niemal całkowicie znosiły ten efekt. W ostrym skrawku cząsteczka macierzysta wykazuje własne działanie.
Ta sama cząsteczka pojawia się z zupełnie innego kierunku
Poza literaturą rosyjską ten sam cykliczny dipeptyd jest badany pod inną nazwą i z inną historią pochodzenia. Prace z University of Auckland traktują cykliczny dipeptyd glicyna-prolina jako metabolit insulinopodobnego czynnika wzrostu 1, a nie jakiegokolwiek estru syntetycznego.
Artykuł z 2014 roku w Scientific Reports podano, że cykliczny peptyd zmienia wiązanie IGF-1 z jego białkiem wiążącym IGFBP-3, nasilając aktywność IGF-1, gdy czynnika wzrostu jest mało, i tłumiąc ją, gdy jest go dużo. W badaniu z 2019 roku zmierzono stężenie peptydu w osoczu 34 pacjentów po udarze i 50 osób z grupy kontrolnej dobranej pod względem wieku; stosunek molowy do IGF-1 był u pacjentów na początku badania niższy i rósł w ciągu 90 dni. Badanie płynu mózgowo-rdzeniowego z 2018 roku obejmowało 11 uczestników.
Są to małe zbiory danych, opisane przez autorów jako eksploracyjne badania biomarkerów, a nie badania mechanizmu. Ich znaczenie jest tu pośrednie, ale rzeczywiste: wskazują endogenną drogę powstawania cząsteczki, przez rozszczepienie czynnika wzrostu, bez udziału jakiegokolwiek związku syntetycznego.
| Rodzaj dowodu | Co zmierzono | Czego nie rozstrzyga |
|---|---|---|
| identyfikacja z 1996 roku | obecność w mózgu szczura, trzy metody chromatograficzne | bezwzględne stężenie; niezależna replikacja |
| metabolizm z 1997 roku | związek macierzysty poniżej granicy wykrywalności, produkt cykliczny podwyższony 2,5-krotnie | gdzie zachodzi cyklizacja; czy związek macierzysty jest nieaktywny |
| elektrofizjologia z 2016 roku | nasilone prądy AMPA przy stężeniu jednomikromolowym | miejsce wiązania, powinowactwo, selektywność |
| blokada w latach 2020 i 2022 | antagoniści znoszą dwa zmierzone efekty | wystarczalność; kolejność zdarzeń w ścieżce |
Tam, gdzie dowody nie wystarczają do ustalenia mechanizmu
Największą strukturalną słabością jest koncentracja autorstwa. Niemal każda praca pierwotna określająca cyklopeptyd jako środek mnemotropowy ma afiliację Zakusov Research Institute of Pharmacology w Moskwie, a większość ukazuje się w dwóch tłumaczonych czasopismach z krótkimi doniesieniami. To spójny program badawczy, a nie rozproszona dziedzina.
Twierdzenie dotyczące metabolitu uogólnia się w sposób osłabiający jego specyficzność. W artykule z 2022 roku na temat innego estru zawierającego prolinę, GZK-111, opisano cztery produkty biotransformacji i ponownie wymieniono ten sam cykliczny dipeptyd wśród nich. Metabolit wspólny dla serii chemicznej jest prawdopodobnym produktem tej serii, ale nie dowodzi, że jest aktywną formą dla któregokolwiek z jej członków.
Najistotniejsza luka dotyczy człowieka. Nie odnaleziono badania farmakokinetycznego wykazującego, że stężenie cyklopeptydu wzrasta w osoczu lub płynie mózgowo-rdzeniowym człowieka po podaniu estru macierzystego, a pomiary z Auckland dotyczą peptydu powstającego z rozszczepienia czynnika wzrostu. Czytana ściśle, literatura uzasadnia wąskie stwierdzenie: cykliczny dipeptyd jest wykrywalny w mózgu gryzoni, jego poziom wzrasta po wprowadzeniu estru macierzystego do organizmu zwierzęcia, a jego działanie w dwóch testach na gryzoniach wymaga nienaruszonej sygnalizacji AMPA i Trk. Każdy krok dalej to hipoteza, która wciąż czeka na eksperyment.
Często zadawane pytania
Czym jest cykloprolyloglicyna, metabolit noopeptu?
Jest to cykliczny dipeptyd o wzorze C7H10N2O2 i masie cząsteczkowej 154,17, powstający w wyniku cyklizacji po rozszczepieniu wiązania estrowego związku macierzystego. Badanie na szczurach z 1997 roku wykazało, że stężenie związku macierzystego było poniżej progu wykrywalności w mózgu, podczas gdy ten produkt wzrósł około 2,5-krotnie, co jest podstawą propozycji proleku. Konwersja nie została jednak potwierdzona u ludzi.
Czy cykloprolyloglicyna jest endogennym peptydem mózgowym?
Opisano ją w mózgu szczurów, którym nic nie podano, w 1996 roku i ponownie w badaniu regionalnym z 2010 roku, występuje więc w tkance, która nie otrzymała żadnej substancji. Pozostają jednak dwie komplikacje: dwa podane stężenia w całym mózgu różnią się około dziesięciokrotnie, a ten sam cykliczny dipeptyd występuje w materiale roślinnym, więc nie można wykluczyć udziału diety w poziomach tkankowych.
Ile cykloprolyloglicyny znajduje się w tkance mózgowej szczura?
Opublikowane dane są rozbieżne. W artykule z 1996 roku, w którym zidentyfikowano peptyd, podano wartość 2,8 nmol na gram mokrego mózgu, oznaczoną metodą chromatografii gazowej. W badaniu z 2010 roku dotyczącym lokalizacji, przeprowadzonym przez ten sam instytut, odnotowano wartości 29,2 nmol na gram w całym mózgu, 38,9 w korze i 126,4 w hipokampie, przy czym około 60% peptydu znajdowało się we frakcji subkomórkowej jądrowej. Nie odnaleziono niezależnego powtórzenia tych wyników.
Czy cykloprolyloglicyna moduluje receptory AMPA?
Jedno badanie elektrofizjologiczne wskazuje, że tak. W 2016 roku grupa z Moskwy zmierzyła nasilone przezbłonowe prądy AMPA w komórkach Purkinjego móżdżku szczura przy stężeniu jednomikromolowym i opisała peptyd jako endogenny modulator dodatni. Nie opublikowano powinowactwa wiązania, a wyniku nie odtworzyło niezależne laboratorium.
Czy cykliczna glicyna-prolina to ta sama cząsteczka co cykloprolyloglicyna?
Tak, obie nazwy opisują ten sam cykliczny dipeptyd. Grupa badawcza z Nowej Zelandii bada go jako metabolit insulinopodobnego czynnika wzrostu 1 i biomarker w osoczu, a grupa rosyjska jako metabolit nootropowy. Oba nurty literatury używają innej nomenklatury, innych oznaczeń i w dużej mierze odrębnych sieci cytowań.
Czy hipoteza dotycząca proleku noopeptu została niezależnie potwierdzona?
Nie w ścisłym sensie. Prawie wszystkie prace pierwotne wskazujące ten metabolit jako formę aktywną pochodzą z jednego moskiewskiego instytutu i ukazują się w dwóch tłumaczonych czasopismach. Niezależne badanie na skrawkach z 2022 roku wykazało, że sam macierzysty dipeptyd działa poprzez receptory nikotynowe α7, co słabo pasuje do koncepcji, że jest on jedynie nośnikiem.
Bibliografia
- Gudasheva et al., FEBS Letters, 1996 – cyklo-prolyloglicyna w mózgu szczura
- Gudasheva et al., Eur J Drug Metab Pharmacokinet, 1997 – główny metabolit GVS-111
- Boiko et al., Bull Exp Biol Med, 2010 – lokalizacja w mózgu szczura
- Gudasheva et al., Dokl Biochem Biophys, 2016 – pozytywny modulator receptorów AMPA
- Gudasheva et al., Dokl Biochem Biophys, 2020 – działanie przeciwlękowe, receptory AMPA i TrkB
- Gudasheva et al., Dokl Biochem Biophys, 2022 – neuroprotekcja, receptory AMPA i TrkB
- Zainullina et al., Bull Exp Biol Med, 2020 – aktywność proliferacyjna komórek
- Kondratenko et al., Neuroscience Letters, 2022 – receptory nikotynowe α7 w CA1
- Kolyvanov et al., Bull Exp Biol Med, 2022 – metabolizm GZK-111 u szczurów
- Guan et al., Scientific Reports, 2014 – cykliczna glicyna-prolina reguluje homeostazę IGF-1
- Fan et al., Ann Clin Transl Neurol, 2019 – stosunek stężeń w osoczu u pacjentów po udarze
- Fan et al., Nutrients, 2018 – cykliczna glicyna-prolina w płynie mózgowo-rdzeniowym
Tylko do celów badawczych. Nonsensia dostarcza wzorce analityczne do zastosowań laboratoryjnych i badawczych. Niniejszy artykuł jest publikowany w celach naukowych i edukacyjnych. Nie stanowi on porady medycznej, nie opisuje żadnego zastosowania u ludzi, a nic w nim zawartego nie powinno być odczytywane jako zalecenie podania jakiejkolwiek substancji osobie lub zwierzęciu.
Kategorie: Badania nad nootropami
Ten artykuł jest częścią naszego przewodnika: Baza dowodowa substancji badawczych w badaniach funkcji poznawczych: przewodnik krytyczny.
Omawiana w tym artykule substancja jest dostępna jako wzorzec analityczny: Noopept (Omberacetam) ≥99% HPLC – wzorzec analityczny | CAS 157115-85-0.