Jak ampakiny spowalniają desensytyzację receptora AMPA

W 2002 roku artykuł opublikowany w Nature dokonał czegoś, czego dziedzinie nie udawało się osiągnąć przez dekadę: nadał desensytyzacji podłoże strukturalne. Pracując z receptorem AMPA GluR2, autorzy wykazali, że rdzenie wiążące ligand łączą się w dimery, a stabilizacja interfejsu wewnątrz każdego dimeru — przez mutację lub modulator allosteryczny — zmniejsza desensytyzację, natomiast zaburzenia destabilizujące ten sam interfejs ją nasilają.

Ten wynik zmienił spojrzenie na całą klasę związków. Wyjaśnia, w jaki sposób ampakiny spowalniają prądy receptorów AMPA i dlaczego pytanie dotyczy interfejsu białkowego, a nie pory kanału.

Dlaczego receptor AMPA zamyka się, choć glutaminian jest nadal związany

Zamknięcie prądu następuje na dwa różne sposoby.

Deaktywacja następuje, gdy agonista się odłącza. Synaptyczny impuls glutaminianu trwa około milisekundy, a po odłączeniu się neuroprzekaźnika rdzeń wiążący ligand o kształcie muszli otwiera się i kanał się zamyka. Desensytyzacja jest bardziej zagadkowa: agonista pozostaje związany, a kanał i tak się zamyka, ponieważ dwa rdzenie wiążące ligand w dimerze przesuwają się względem siebie i odprzęgają każdą podjednostkę od bramki, którą ma ona otwierać.

Elektrofizjologia rozdziela te dwa zjawiska sposobem podania agonisty. Impuls trwający jedną milisekundę na wyciętym fragmencie błony w konfiguracji outside-out rejestruje kinetykę deaktywacji; przedłużone podanie rejestruje desensytyzację, ponieważ prąd narasta, a następnie zanika, gdy glutaminian jest wciąż obecny. Obie odpowiedzi często nie są takie same.

Jak ampakiny spowalniają desensytyzację i deaktywację receptorów AMPA

Ampakiny to, zgodnie z definicją stosowaną w literaturze przeglądowej, leki strukturalnie pochodne od aniracetamu, które nasilają prądy przewodzone przez receptory glutaminianowe typu AMPA. Przegląd z 2007 roku w Current Drug Targets podsumowuje ich wspólny profil: spowalniają deaktywację, osłabiają desensytyzację, zwiększają odpowiedzi synaptyczne i ułatwiają długotrwałe wzmocnienie synaptyczne w skrawkach hipokampa. Przegląd badań przedklinicznych z 2005 roku dodaje najważniejsze zastrzeżenie — związki te nie mają własnej aktywności i działają wyłącznie przez zmianę tempa, w jakim już aktywowany receptor ulega desensytyzacji.

Modulator bez wewnętrznego działania agonistycznego nie może wywołać prądu, gdy glutaminian jest nieobecny. Może natomiast zmienić kształt i czas trwania prądu, który został już wywołany przez uwolnienie synaptyczne.

Wielkości efektów są mierzalne, ale nie spektakularne. W hodowlach neuronów hipokampa szczura benzotiadiazyd 7-chloro-3-metylo-3,4-dihydro-2H-1,2,4-benzotiadiazyno-S,S-ditlenek wydłużał autaptyczne prądy AMPA do 5,6-krotności wartości kontrolnej, przy stężeniu wywołującym połowę maksymalnego efektu wynoszącym 150 mikromoli na litr, oraz spowalniał deaktywację AMPA około trzykrotnie po jednomilisekundowych aplikacjach glutaminianu o stężeniu jednego milimola na litr. To samo badanie z 1998 roku odnotowało niewygodne działanie dodatkowe: związek hamował o 41% prądy całokomórkowe wywołane egzogennym GABA, jednocześnie nieznacznie nasilając synaptyczne prądy GABA-ergiczne.

Gdzie pozytywne modulatory allosteryczne wiążą się w interfejsie dimeru

Miejsce wiązania ustalono metodą krystalografii w 2005 roku. Struktury kokryształów domeny wiążącej ligand GluR2 S1S2 z aniracetamem i z ampakiną CX614 umieściły obie cząsteczki wewnątrz interfejsu dimeru receptora niedesensytyzowanego, we wspólnym miejscu na dwukrotnej osi symetrii cząsteczki. Ta kieszeń leży obok zawiasu muszli, czyli części, która ulega przegrupowaniu po związaniu glutaminianu. Mutacje punktowe reszt kontaktujących się z modulatorami zaburzały ich działanie w zapisach metodą patch clamp. Proponowany mechanizm jest swoisty: modulator stabilizuje muszlę w konformacji z zamkniętą szczeliną i związanym glutaminianem, a deaktywacja zwalnia, ponieważ agonista potrzebuje więcej czasu, aby się uwolnić.

Późniejsze prace zmapowały tę samą kieszeń za pomocą serii związków. Badanie z 2009 roku w Biochemistry zbadało miejsce wiązania modulatorów w GluR2 za pomocą pochodnych tiazydowych, odnotowując, że stan desensytyzacji jest rutynowo eliminowany dla uproszczenia analizy aktywacji receptora za pomocą cyklotiazydu, najsilniejszego modulatora tej rodziny. W 2012 roku dołączyła termodynamika: izotermiczna kalorymetria miareczkowa na stabilizowanym dimerycznym mutancie domeny wiążącej ligand GluA2 pozwoliła bezpośrednio zmierzyć stałe dysocjacji. Referencyjny modulator BPAM-97 wiązał się ze stałą dysocjacji 5,6 mikromola na litr; test wypierania wyznaczył dla benzotiadiazyny IDRA-21 wartość 0,46 milimola na litr. Krystalografia przypisała większość tej różnicy kontaktom van der Waalsa tworzonym przez pojedynczy podstawnik etylowy, głównie z Met496.

Dwie podrodziny ampakin, które nie konkurują ze sobą w testach wiązania

Przegląd z 2007 roku dzieli tę klasę na dwie podrodziny na podstawie kryteriów fizjologicznych, a nie strukturalnych. Związki typu I, takie jak CX546, bardzo skutecznie przedłużają odpowiedzi synaptyczne; związki typu II, takie jak CX516, głównie zwiększają amplitudę odpowiedzi. Obie klasy nie konkurują ze sobą w testach wiązania, co dowodzi, że zajmują odrębne miejsca. Wszystkie badane ampakiny ułatwiały długotrwałe wzmocnienie synaptyczne, ale tylko CX546 nasilał długotrwałe osłabienie synaptyczne, a efekty różniły się w zależności od typu komórek.

Badanie z 2001 roku w Neuropharmacology porównało oba chemotypy pod kątem kinetyki bramkowania. CX546 zmniejszał desensytyzację silniej niż CX516 lub IDRA-21, ale mniej skutecznie niż cyklotiazyd. Zwiększał około trzykrotnie powinowactwo agonisty do receptorów niedesensytyzujących przez spowolnienie odłączania się agonisty, a analiza wskazała na coś, czego benzotiadiazydy nie robią: CX546 wydawał się wiązać swoiście z receptorem związanym z agonistą i niedesensytyzowanym, destabilizując konformację desensytyzowaną, a nie zapobiegając przejściu w nią.

Związek	Klasa chemiczna	Opisany efekt
Cyklotiazyd	Benzotiadiazyd	Najsilniejsze zahamowanie desensytyzacji w serii
IDRA-21	Benzotiadiazyd	Częściowy modulator; milimolowa stała dysocjacji wyznaczona metodą wypierania
CX516	Benzoilopiperydyna, typ II	Głównie zwiększa amplitudę odpowiedzi
CX546	Benzoilopiperydyna, typ I	Wydłuża odpowiedzi synaptyczne; spowalnia dysocjację agonisty
CX614	Benzoksazyna	Współkrystalizowany w interfejsie dimeru; spowalnia dezaktywację

Dlaczego pojedynczy podstawnik alkilowy zmienia sygnaturę kinetyczną

Seria benzotiadiazydów pozwala odczytać tę zależność. Badanie z 2002 roku opublikowane w Molecular Pharmacology wykazało, że wielkość podstawnika w pozycji 5 prim decydowała nie tylko o sile działania, ale też o charakterze efektu. Pochodna 5 prim-etylowa, oznaczona jako D1, blokowała desensytyzację ze stężeniem wywołującym połowę maksymalnego efektu 36 mikromoli na litr i ponad dziesięciokrotnie spowalniała deaktywację odpowiedzi na jednomilisekundowe impulsy glutaminianu. Wiązanie radioliganda z błonami synaptycznymi szczura wzrosło 3,6-krotnie, przy współczynniku Hilla bliskim dwóm.

Rozkład efektu między amplitudę a czas trwania zależał od podstawnika. Związki z grupą metylową w pozycji 5 prim miały mniej więcej dwukrotnie większy wpływ na amplitudę niż na czas trwania; związki 5 prim-etylowe, takie jak D1, działały odwrotnie. D1 preferował też wariant splicingowy GluR4 flip, z wartością 0,64 mikromola na litr, względem GluR4 flop z wartością 5,3 mikromola na litr — taka selektywność wobec wariantów splicingowych czyni te modulatory użytecznymi narzędziami do rozróżniania podtypów.

Jak podjednostki TARP zmieniają farmakologię ampakin

Natywny receptor AMPA nie jest samym tetramerem. Transbłonowe białka regulatorowe receptora AMPA, w skrócie TARP, kontrolują ekspresję powierzchniową i ustalają powinowactwo agonistów oraz kinetykę desensytyzacji i deaktywacji. Badanie z 2018 roku w Biochemical Pharmacology zbadało CX614 i cyklotiazyd na homomerycznych receptorach GluR1 flip i GluR2 flop eksprymowanych w komórkach HEK293 z białkami gamma-2, gamma-3, gamma-4 lub gamma-8 albo bez nich.

Gamma-4 dała największy wzrost powinowactwa obu modulatorów do GluR1 flip, ale nie miała takiego efektu na GluR2 flop, gdzie zamiast tego największy wzrost wykazała gamma-8. Wpływ TARPów na farmakologię ampakin jest zatem złożony i zależy jednocześnie od podtypu TARP oraz obecnej podjednostki receptora i izoformy splicingowej.

Ma to bezpośrednie znaczenie dla sposobu odczytywania wyniku in vitro. Siła działania zmierzona na rekombinowanym homomerze jest właściwością tego układu ekspresyjnego, a nie stałą związku.

Co się stało, gdy chemia dotarła do badania klinicznego

Literatura mechanistyczna jest znacznie mocniejsza niż dane kliniczne. Do opublikowanego w 2006 roku badania fazy II z randomizacją, podwójnie zaślepionego, z grupą kontrolną otrzymującą placebo, oceniającego CX516 w zespole łamliwego chromosomu X, włączono 49 osób, które przeszły tygodniowy okres wstępny z placebo i czterotygodniowy okres leczenia. Działania niepożądane były minimalne i nie wystąpiły ciężkie zdarzenia niepożądane, choć w ramieniu CX516 wysypka alergiczna pojawiła się z częstością 12,5%.

Pierwszorzędowym punktem końcowym była pamięć i nie stwierdzono jej istotnej poprawy, podobnie jak w drugorzędowych punktach końcowych dotyczących języka, uwagi i funkcji wykonawczych, zachowania czy ogólnego funkcjonowania. Autorzy zaznaczyli, że problemy z siłą działania w innych badaniach nie pozwalają stwierdzić, czy modulacja neuroprzekaźnictwa zależnego od receptorów AMPA jest w ogóle realną strategią terapeutyczną w tym schorzeniu. Badanie z wynikiem zerowym, z przyznanym zastrzeżeniem dotyczącym siły działania, niewiele rozstrzyga i nie przekształca struktury interfejsu dimeru w twierdzenie kliniczne.

Na początku tego wszystkiego stoi ograniczenie laboratoryjne. Wyniki elektrofizjologii przy stężeniach mikromolowych i milimolowych dają się interpretować tylko wtedy, gdy udokumentowano tożsamość, czystość oraz — jeśli istnieje centrum stereogeniczne — skład enancjomeryczny badanej substancji. Materiał używany w warunkach badawczych podlega warunkom dotyczącym odczynników laboratoryjnych.

Często zadawane pytania

Jaka jest różnica między desensytyzacją a deaktywacją receptora AMPA?

Deaktywacja to zamknięcie kanału po odłączeniu agonisty, mierzone za pomocą krótkich impulsów glutaminianu na wyciętych fragmentach błony. Desensytyzacja to zamknięcie kanału, gdy agonista pozostaje związany, mierzone podczas przedłużonego podania. Prace strukturalne nad GluR2 powiązały desensytyzację z przegrupowaniem interfejsu dimeru, które odprzęga rdzeń wiążący ligand od bramki.

Gdzie wiążą się pozytywne allosteryczne modulatory na receptorze AMPA?

Wewnątrz interfejsu dimeru domeny wiążącej ligand, a nie w porze kanału. Struktury kokryształów domeny S1S2 receptora GluR2 z aniracetamem i CX614 umieściły oba związki we wspólnym miejscu na dwukrotnej osi symetrii, obok zawiasu muszli. Mutacja reszt kontaktujących się z modulatorem zaburzała jego działanie.

Czy wszystkie ampakiny działają na tym samym miejscu wiązania?

Nie. Badania fizjologiczne rozróżniają co najmniej dwie podrodziny. Związki typu I, takie jak CX546, głównie wydłużają odpowiedzi synaptyczne, a związki typu II, takie jak CX516, głównie zwiększają amplitudę, przy czym obie podrodziny nie konkurują ze sobą w testach wiązania. Ten brak konkurencji wskazuje na odrębne miejsca wiązania.

Dlaczego cyklotiazyd działa w tych testach silniej niż IDRA-21?

Z powodu kontaktów tworzonych przez mały podstawnik. Kalorymetria na stabilizowanej domenie wiążącej ligand GluA2 wykazała stałą dysocjacji 5,6 mikromola na litr dla modulatora referencyjnego BPAM-97 wobec 0,46 milimola na litr dla IDRA-21; różnicę przypisuje się głównie oddziaływaniom van der Waalsa grupy etylowej.

Czy białka TARP zmieniają siłę działania ampakin?

Tak, i nie w jednakowy sposób. Badanie CX614 i cyklotiazydu w komórkach HEK293 wykazało, że gamma-4 daje największy wzrost powinowactwa do receptorów GluR1 flip, ale nie do GluR2 flop, gdzie dominowała gamma-8. Efekt zależy od podtypu TARP i od eksprymowanej izoformy splicingowej.

Co wykazało badanie kliniczne CX516 w zespole łamliwego chromosomu X?

W badaniu fazy II randomizowano 49 osób do czterotygodniowego okresu leczenia; działania niepożądane były minimalne, a wysypka alergiczna wystąpiła u 12,5% osób w ramieniu leczonym. Pierwszorzędowy punkt końcowy, pamięć, nie wykazał istotnej poprawy względem placebo; nie wykazały jej też drugorzędowe punkty końcowe.

Bibliografia

Tylko do celów badawczych. Nonsensia dostarcza wzorce analityczne do zastosowań laboratoryjnych i badawczych. Niniejszy artykuł jest publikowany w celach naukowych i edukacyjnych. Nie stanowi on porady medycznej, nie opisuje żadnego zastosowania u ludzi, a nic w nim zawartego nie powinno być odczytywane jako zalecenie podania jakiejkolwiek substancji osobie lub zwierzęciu.

Kategorie: Badania nad nootropami

Ten artykuł jest częścią naszego przewodnika: Baza dowodowa substancji badawczych w badaniach funkcji poznawczych: przewodnik krytyczny.

Wzorzec analityczny dla omawianej substancji jest obecnie niedostępny. Dostępne są następujące powiązane wzorce analityczne: Aniracetam ≥99% – wzorzec analityczny | CAS 72432-10-1, Coluracetam ≥99% HPLC – wzorzec analityczny | CAS 135463-81-9, Noopept (Omberacetam) ≥99% HPLC – wzorzec analityczny | CAS 157115-85-0, Oxiracetam ≥99% HPLC – wzorzec analityczny, 1000 mg | CAS 62613-82-5.

Modulacja receptora AMPA: co ampakiny robią na poziomie molekularnym