Dlaczego mechanizm działania racetamów pozostaje nieznany

W 1973 roku czasopismo Conditional Reflex opublikowało artykuł Corneliu Giurgei zatytułowany "The 'nootropic' approach to the pharmacology of the integrative activity of the brain". Słowo to weszło do farmakologii jako opis profilu behawioralnego, a nie celu molekularnego. Dwadzieścia jeden lat później przegląd w Brain Research Reviews przeanalizował 407 artykułów z lat 1965-1992 i stwierdził, że dla tej klasy nie ustalono powszechnie akceptowanego mechanizmu działania.

Szesnaście lat później przegląd z 2010 roku w Drugs ujął to dosadniej: mechanizmy działania piracetamu i większości jego pochodnych pozostają zagadką. To krótka odpowiedź na pytanie, dlaczego mechanizm racetamów jest nadal nieznany — nie dlatego, że nikt go nie badał, ale dlatego, że pięć dekad badań przyniosło kilka częściowych mechanizmów, których nie da się sprowadzić do jednego.

Klasa nazwana przed poznaniem jej celu

Wspólny element strukturalny jest niewielki. PubChem wymienia piracetam pod identyfikatorem związku 4843, CAS 7491-74-9, wzór sumaryczny C6H10N2O2, masa cząsteczkowa 142,16, nazwa systematyczna 2-(2-oksopirolidyn-1-ylo)acetamid. Aniracetam figuruje pod identyfikatorem 2196, CAS 72432-10-1, wzór C12H13NO3, masa cząsteczkowa 219,24, nazwa systematyczna 1-(4-metoksybenzoilo)pirolidyn-2-on.

Oba mają pierścień 2-oksopirolidyny. Poza tym się różnią: piracetam ma przy azocie pierścienia małe polarne ramię acetamidowe, aniracetam aromatyczną grupę anizoilową. Szkielet, który w tej samej pozycji toleruje zarówno polarny amid, jak i lipofilowy podstawnik aroilowy, nie wygląda na taki, który koduje jeden sposób wiązania.

Klasę zdefiniowano od drugiej strony. Związki te scharakteryzowano najpierw w zwierzęcych modelach behawioralnych — odwracanie amnezji wywołanej u gryzoni skopolaminą, elektrowstrząsem lub niedotlenieniem — i dopiero później zaczęto szukać odpowiedzialnego za ich działanie białka. Klasyczna farmakologia postępuje według schematu: cel, następnie ligand, następnie zależność stężenie-odpowiedź. Tutaj sekwencja biegła odwrotnie i nigdy się nie domknęła.

Dlaczego mechanizm działania racetamów pozostaje nieznany po pięćdziesięciu latach

Dwa przeglądy oddzielone szesnastoma latami doszły do niemal identycznych wniosków. Przegląd z 1994 roku stwierdził, że nie wyłonił się żaden ogólnie przyjęty mechanizm, i zaproponował zamiast tego wzmacnianie już trwającej neurotransmisji — przez modulację przepływu jonów, taką jak zwiększony napływ wapnia przez kanały zależne od napięcia inne niż typu L, zwiększony napływ sodu przez kanały bramkowane receptorami AMPA lub zmniejszony wypływ potasu. Przegląd z 2010 roku wskazał na zróżnicowany wpływ na podtypy receptorów glutaminianowych zamiast działania GABA-ergicznego i zakwestionował wyjaśnienie wapniowe na tej podstawie, że trwały napływ wapnia sam w sobie uszkadza neurony.

Żadne z tych stwierdzeń nie jest mechanizmem w tym sensie, w jakim mechanizmem jest miejsce wiązania. Oba opisują efekt końcowy, pozostawiając otwartą kwestię przyczyny wyjściowej.

Co wykluczyły badania przesiewowe receptorów

Najbardziej pouczające dane dotyczące racetamów są negatywne. Przegląd z 1994 roku zebrał badania nad wiązaniem dla standardowego panelu receptorów tamtego okresu i stwierdził brak powinowactwa do miejsc alfa-1, alfa-2 i beta adrenergicznych, muskarynowych, 5-hydroksytryptaminowych, dopaminergicznych, adenozynowych A1, mu-opioidowych, GABA, benzodiazepinowych lub glutaminianowych. Jedynym zauważonym wyjątkiem był nefiracetam w przypadku receptora GABA-A.

Związek o mierzalnej aktywności behawioralnej u zwierząt i bez mierzalnego powinowactwa do któregokolwiek celu z tego panelu zmusza do szukania gdzie indziej. Otworzyły się dwie drogi: jedna traktuje samą dwuwarstwę jako miejsce działania, druga szuka miejsc allosterycznych, których konwencjonalny test wypierania nigdy by nie wykrył, ponieważ nie są ortosteryczne i są obsadzane jedynie słabo.

Hipoteza płynności błony i na czym się opiera

Wyjaśnienie błonowe ma bezpośrednie wsparcie biofizyczne. Badanie z 1995 roku w Biochemical Pharmacology łączyło spektroskopię magnetycznego rezonansu jądrowego fosforu-31 z analizą konformacyjną na modelowych błonach z fosfatydylocholiny i fosfatydyloetanoloaminy. Piracetam wywoływał modyfikację strukturalną tych liposomów, interpretowaną jako swoiste oddziaływanie z fosforanowymi grupami polarnymi, prowadzące do powstania ruchliwych kompleksów lek-fosfolipid, które dają w widmie sygnał izotropowy.

Artykuł z 1999 roku w Pharmacopsychiatry rozszerzył tę koncepcję na tkankę mózgową, podając, że piracetam modyfikuje właściwości błon przez oddziaływanie z polarnymi grupami główkowymi dwuwarstwy, wyraźniej w błonach z mózgów starych zwierząt i ludzi niż z mózgów młodych. Przegląd z 2005 roku w CNS Drug Reviews przypisał efekty fizjologiczne przynajmniej częściowo przywróceniu płynności błony. Części kliniczne tych przeglądów wykraczają poza zakres niniejszego artykułu.

Hipoteza ma niewygodną właściwość: trudno ją sfalsyfikować typowymi narzędziami farmakologicznymi. Nie ma testu wiązania dla oddziaływania z dwuwarstwą, mutacji punktowej, która by je znosiła, ani antagonisty, który by z nim konkurował. Fizykochemiczny mechanizm działania można zmierzyć spektroskopowo, ale nie można go potwierdzić ani wykluczyć metodami, którymi ustalono wszystkie inne cele leków tamtej epoki.

Co krystalografia ujawniła na temat interfejsu receptora AMPA

Nurt elektrofizjologiczny rozpoczął się wcześniej i zmierzał ku czemuś konkretnemu. Badanie z 1990 roku w The Journal of Physiology wykorzystało oocyty Xenopus, którym wstrzyknięto mRNA z mózgu szczura, oraz skrawki hipokampa szczura i wykazało, że aniracetam odwracalnie nasilał jonotropowe odpowiedzi na kwiskwalan przy stężeniach powyżej 0,1 milimola na litr, nie wpływając na odpowiedzi na kainian, NMDA i GABA w tych samych oocytach. Nasilenie przejawiało się jako większa zmiana przewodności, bez przesunięcia powinowactwa agonisty i bez zmiany potencjału odwrócenia. Pobudzające potencjały postsynaptyczne ulegały wzmocnieniu w synapsach kolaterali Schaffera z neuronami CA1 oraz w synapsach włókien kiciastych z neuronami CA3.

Dwadzieścia lat później biologia strukturalna zlokalizowała to miejsce. Artykuł z 2010 roku opublikowany w Journal of Medicinal Chemistry określił struktury domen wiążących ligand podjednostek receptora AMPA GluA2 i GluA3 z piracetamem oraz GluA3 z aniracetamem. Oba związki wiązały się z obiema podjednostkami w podobny sposób, co wskazuje na niewielką swoistość wobec podjednostek — ale ich miejsca wiązania znacznie się od siebie różniły. Aniracetam zajmował symetryczne miejsce w centrum interfejsu dimeru. Piracetam wiązał się w wielu miejscach wzdłuż tego samego interfejsu przy niskim obsadzeniu; jedno z nich autorzy opisują jako nowe miejsce wiązania modulatorów allosterycznych.

To najostrzejsze dostępne stwierdzenie problemu. Prace strukturalne, które mogły zjednoczyć klasę, zamiast tego ją podzieliły: dwa związki dzielące układ pierścieniowy, działające na ten sam kompleks receptorowy, poprzez różne geometrie. Prace tego rodzaju zależą od materiału o określonej tożsamości i czystości, dlatego badania interfejsów wykorzystują scharakteryzowany wzorzec analityczny aniracetamu.

Oddzielny wynik ponownie komplikuje obraz. Badanie z 2000 roku w Neuropharmacology zmierzyło uwalnianie acetylocholiny w korze przedczołowej szczura metodą mikrodializy in vivo i wykazało, że opóźnione uwalnianie następowało po perfuzji metabolitem N-anizoylo-GABA, a nie samym aniracetamem. Było ono całkowicie blokowane przez antagonistów metabotropowych receptorów glutaminianowych MCPG i MCCG i w dużej mierze niewrażliwe na selektywny wobec grupy I AIDA oraz na antagonistę receptora AMPA YM90K. W tym eksperymencie wątek cholinergiczny przebiega przez metabolit i przez inną rodzinę receptorów niż ta, którą wskazała krystalografia.

Jedyny racetam, który doczekał się celu molekularnego

Kontrast, który sprawia, że reszta jest czytelna, to lewetyracetam. W artykule z 2004 roku opublikowanym w Proceedings of the National Academy of Sciences zidentyfikowano białko pęcherzyków synaptycznych SV2A jako miejsce wiązania lewetyracetamu w mózgu, z dowodami o charakterze, jakiego starsza literatura dotycząca racetamów nigdy nie dostarczyła: znakowanie fotoafinityczne daje pozorną masę około 90 kilodaltonów; błony z myszy pozbawionych SV2A nie wiążą trytowanej pochodnej lewetyracetamu; ekspresja w fibroblastach wystarcza do nadania zdolności wiązania; izoformy SV2B i SV2C nie wiążą; a powinowactwo w serii pochodnych koreluje z ochroną w modelu napadów audiogennych.

Konieczność, wystarczalność, selektywność izoform i korelacja struktura-aktywność, w jednym artykule. Przegląd z 2010 roku grupuje lewetyracetam z seletracetamem i brivaracetamem jako podgrupę działającą przez to białko.

Hipoteza	Główny dowód	Czego brakuje
Płynność błony	Spektroskopia NMR fosforu-31 na modelowych dwuwarstwach lipidowych	Brak miejsca wiązania, brak mutanta, brak antagonisty
Modulacja receptora AMPA	Elektrofizjologia; struktury krystaliczne na styku dimeru	Dwa związki, dwa różne miejsca działania
Udział układu cholinergicznego	Mikrodializa w korze przedczołowej szczura	Efekt przypisywany metabolitowi, blokowany przez antagonistów receptorów mGlu
Wiązanie z SV2A	Nokaut genu, ekspresja w fibroblastach, selektywność izoform, korelacja struktura-aktywność	Ustalone dla lewetyracetamu, nie dla piracetamu

Przypadek lewetyracetamu pokazuje, czego wymaga domknięcie: programu przeciwdrgawkowego z twardym punktem końcowym, genetycznego zwierzęcia kontrolnego i sondy fotoafinitycznej. Związku macierzystego nigdy nie badano w ten sposób, a pytanie pozostało otwarte z tego samego powodu, z którego otwarta pozostaje większość pytań — decydującego eksperymentu nigdy na nim nie przeprowadzono.

Często zadawane pytania

Dlaczego mechanizm racetamów pozostaje nieznany po pięćdziesięciu latach?

Ponieważ klasę zdefiniowano behawioralnie, a nie przez cel, a poszukiwania prowadzone w odwrotnym kierunku nigdy nie zbiegły się w jednym wyniku. Przegląd 407 artykułów z 1994 roku nie znalazł ogólnie przyjętego mechanizmu, a przegląd z 2010 roku nadal opisywał sposoby działania jako zagadkę. Kilka częściowych mechanizmów ma poparcie; żaden nie obejmuje pozostałych.

Jaki jest mechanizm działania piracetamu?

Nie ma ustalonego mechanizmu. Opublikowane hipotezy obejmują oddziaływanie z grupami główkowymi fosfolipidów, zmieniające właściwości błony, allosteryczną modulację na styku dimeru receptora AMPA wykazaną krystalograficznie oraz modulację przepływu jonów szlakami wapniowymi, sodowymi i potasowymi. Przeglądy z 1994 i 2010 roku stwierdzają, że nie ma konsensusu co do mechanizmu.

W jaki sposób aniracetam moduluje receptory AMPA?

Elektrofizjologia w 1990 roku wykazała odwracalne nasilenie jonotropowych odpowiedzi na kwiskwalan przy stężeniach powyżej 0,1 milimola na litr, widoczne jako większa zmiana przewodności bez przesunięcia powinowactwa agonisty ani potencjału odwrócenia i bez wpływu na odpowiedzi na kainian, NMDA czy GABA. Krystalografia umieściła później związek w symetrycznym miejscu na styku dimeru receptora.

Co wykazała struktura krystaliczna piracetamu?

Badanie z 2010 roku rozwiązało struktury domen wiążących ligand podjednostek receptorów AMPA GluA2 i GluA3 z przyłączonym piracetamem. Zamiast jednej określonej kieszeni piracetam zajmował wiele miejsc wzdłuż interfejsu dimeru przy niskim obsadzeniu, z których jedno było wcześniej nieopisane. Aniracetam wiązał się natomiast w pojedynczym symetrycznym miejscu w centrum interfejsu.

Dlaczego piracetam nie wiąże się z klasycznymi receptorami?

Badania przesiewowe na standardowym panelu nie wykazały powinowactwa do receptorów adrenergicznych, muskarynowych, serotoninergicznych, dopaminergicznych, adenozynowych A1, opioidowych μ, GABA, benzodiazepinowych ani glutaminianowych, z nefiracetamem jako jedynym wyjątkiem odnotowanym dla receptorów GABA-A. Ten negatywny wynik skierował badania w stronę interakcji błonowych i słabo zajętych miejsc allosterycznych.

Kto wprowadził termin nootropowy i kiedy?

Corneliu Giurgea w pracy zatytułowanej "The ‘nootropic’ approach to the pharmacology of the integrative activity of the brain", opublikowanej w Conditional Reflex w 1973 roku. Termin opisywał profil behawioralny obserwowany w modelach zwierzęcych, w czasie gdy nie zidentyfikowano jeszcze celu molekularnego dla związków, do których go stosowano.

Czym lewetyracetam różni się od piracetamu?

Lewetyracetam ma zidentyfikowany cel molekularny, a piracetam nie. Badanie z 2004 roku ustaliło, że jego miejscem wiązania jest białko pęcherzyków synaptycznych SV2A, wykorzystując myszy z nokautem genu, ekspresję heterologiczną, selektywność izoform i korelację struktura-aktywność z ochroną przed napadami. Dla związku macierzystego nie istnieje porównywalny zbiór dowodów.

Bibliografia

Tylko do celów badawczych. Nonsensia dostarcza wzorce analityczne do zastosowań laboratoryjnych i badawczych. Niniejszy artykuł jest publikowany w celach naukowych i edukacyjnych. Nie stanowi on porady medycznej, nie opisuje żadnego zastosowania u ludzi, a nic w nim zawartego nie powinno być odczytywane jako zalecenie podania jakiejkolwiek substancji osobie lub zwierzęciu.

Kategorie: Badania nad nootropami

Ten artykuł jest częścią naszego przewodnika: Baza dowodowa substancji badawczych w badaniach funkcji poznawczych: przewodnik krytyczny.

Omawiana w tym artykule substancja jest dostępna jako wzorzec analityczny: Aniracetam ≥99% – wzorzec analityczny | CAS 72432-10-1.

Racetamy i ich brakujący mechanizm: pięćdziesiąt lat bez konsensusu