Skąd pochodzą końcowe produkty zaawansowanej glikacji

W 1981 roku Vincent Monnier i Anthony Cerami inkubowali białka soczewki z cukrami redukującymi i obserwowali, jak żółkną. Barwniki były fluorescencyjne, białka ulegały sieciowaniu, a obie te cechy przypominały to, co patolodzy opisali w starzejących się ludzkich soczewkach i soczewkach z zaćmą. Reakcja miała już nazwę, zapożyczoną z chemii żywności: nieenzymatyczne brązowienie, reakcja Maillarda. W artykule opublikowanym w Science dowodzili, że ta sama chemia, która powoduje brązowienie przechowywanej żywności, zachodzi również – powoli – w żywym organizmie.

Krótka odpowiedź na pytanie, skąd pochodzą zaawansowane końcowe produkty glikacji (AGE), brzmi: powstają w wyniku reakcji cukrów z białkami bez udziału enzymów, zarówno w garnku, jak i w kapilarze, według tego samego mechanizmu. Dłuższa odpowiedź jest ciekawsza, ponieważ obie drogi osadzają różne cząsteczki w różnym tempie, a przyrządy używane do ich liczenia nie zgadzają się ze sobą.

Reakcja Maillarda zachodząca wewnątrz organizmu

Pierwszym etapem jest kondensacja cukru redukującego z wolną grupą aminową na białku – najczęściej z grupą epsilon-aminową reszty lizyny. Addukt ulega przegrupowaniu, dehydratacji i przechodzi do heterogenicznej rodziny produktów końcowych: niektóre są zabarwione, niektóre fluorescencyjne, niektóre zdolne do mostkowania dwóch łańcuchów białkowych.

Monnier i Cerami podkreślili kluczowy aspekt, który nadal kształtuje tę dziedzinę. Większość białek w żywych systemach odnawia się na tyle szybko, że zostaje zastąpiona, zanim którykolwiek z tych procesów nabierze znaczenia. Nieliczne jednak nie ulegają tak szybkiej wymianie. Krystaliny soczewki i kolagen skóry są wyjątkowo długowieczne, i to właśnie w tych białkach kumulują się efekty reakcji Maillarda.

Glukoza jest powolnym czynnikiem glikującym. Znaczna część przypisywanych jej szkód jest wynikiem działania dikarbonylowych związków pośrednich powstających na dalszych etapach, przede wszystkim metyloglioksalu (PubChem CID 880; C3H4O2; 72,06 g/mol; CAS 78-98-8), który reaguje z argininą i lizyną o rzędy wielkości szybciej niż glukoza. Najlepiej scharakteryzowanym stabilnym adduktem jest N-epsilon-(karboksymetylo)lizyna, powszechnie skracana jako CML (PubChem CID 123800; C8H16N2O4; 204,22 g/mol; CAS 5746-04-3). CML jest stabilna i stosunkowo obojętna i właśnie dlatego jest używana jako marker: przetrwa wystarczająco długo, aby można ją było policzyć.

Skąd pochodzą końcowe produkty zaawansowanej glikacji w żywności

Produkty te znajdują się w żywności jeszcze przed jej spożyciem, a podgrzewanie powoduje ich dalsze powstawanie. Dwie grupy badawcze stworzyły bazy danych o zawartości AGE w żywności, korzystając z różnych instrumentów, a porównanie tych danych jest pouczające.

Pierwsze z nich, opublikowane przez Uribarri i współpracowników w 2010 roku, obejmuje 549 produktów spożywczych. Próbki zostały homogenizowane, a supernatanty analizowano metodą enzymatycznego testu immunosorpcyjnego opartego na monoklonalnym przeciwciele anty-CML, z wynikami wyrażonymi w kilojednostkach AGE na 100 g. Sucha obróbka cieplna zwiększała powstawanie nowych AGE ponad 10- do 100-krotnie w stosunku do stanu surowego w różnych kategoriach żywności. Produkty pochodzenia zwierzęcego bogate w tłuszcz i białko były zazwyczaj bogate w AGE i podatne na dalsze ich tworzenie podczas gotowania; produkty bogate w węglowodany, takie jak warzywa, owoce, pełne ziarna i mleko, zawierały stosunkowo niewiele AGE, nawet po ugotowaniu. Powstawanie AGE było zmniejszane przez wilgotną obróbkę cieplną, krótsze czasy gotowania, niższe temperatury i kwaśne składniki, takie jak sok z cytryny lub ocet, a w ich oznaczeniach całkowicie hamował je inhibitor aminoguanidyna.

Druga praca, opublikowana przez Scheijena i współpracowników w 2016 r., określiła ilościowo trzy nazwane związki – CML, N-epsilon-(1-karboksyetylo)lizynę (CEL) oraz pochodzący od metyloglioksalu MG-H1 – we frakcji białkowej 190 produktów spożywczych metodą ultrasprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas. Najwyższe poziomy odnotowano w przetwarzanych w wysokiej temperaturze produktach orzechowych lub zbożowych oraz w konserwach mięsnych; najniższe w owocach, warzywach, maśle i kawie.

Obie bazy danych są zasadniczo zgodne co do kierunku i nie zgadzają się prawie we wszystkim innym. Jedna raportuje aktywność zdefiniowaną przez przeciwciało w umownych kilojednostkach; druga podaje ilości molowe trzech konkretnych cząsteczek. Liczby z jednej nie można przekonwertować na liczbę z drugiej. To stwierdzenie dotyczy chemii analitycznej, a nie zalecenia dietetycznego.

Sieciowanie i przypadek glukozepanu

Brązowienie jest procesem kosmetycznym. Tworzenie wiązań krzyżowych ma charakter mechaniczny. Gdy produkt reakcji Maillarda tworzy pomost między dwoma łańcuchami kolagenu, macierz sztywnieje i staje się odporna na trawienie proteolityczne, co jest zmianą związaną ze starzeniem tkanek i przyspieszoną w cukrzycy. Przez lata znane wiązania krzyżowe występowały w ilościach zbyt małych, aby wyjaśnić ten efekt.

Sell i współpracownicy zajęli się tym w 2005 r., mierząc wiązania sieciujące lizyna–arginina pochodzące od glukozy, metyloglioksalu, glioksalu i 3-deoksyglukozonu – glukozepan, MODIC, GODIC i DOGDIC – w enzymatycznie strawionym kolagenie ludzkiej skóry (n = 110) i błonie podstawnej kłębuszków nerkowych (n = 28), z użyciem chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas i rozcieńczeniem izotopowym. U osób kontrolnych bez cukrzycy w wieku 90 lat poziomy osiągały odpowiednio 2000, 30 i 15 pmol/mg dla glukozepanu, MODIC i GODIC. Cukrzyca podnosiła poziom glukozepanu do 5000 pmol/mg (p < 0,0001), podczas gdy pozostałe utrzymywały się poniżej 60 pmol/mg. Glukozepan (PubChem CID 135565852; C18H32N6O6; 428,5 g/mol; CAS 257290-23-6) był – jak podsumowali autorzy – jedynym głównym wiązaniem sieciującym starzejącej się macierzy zewnątrzkomórkowej odkrytym do tej pory, odpowiadając w cukrzycy nawet za ponad 120% molowych modyfikacji potrójnej helisy kolagenu.

Glukozepan od kolejnego wiązania sieciującego w tym zbiorze danych dzielą dwa rzędy wielkości. Każdy opis glikacji, który zatrzymuje się na CML, mierzy marker najłatwiejszy do wykrycia, a nie modyfikację, która wykonuje pracę strukturalną.

Jak mierzy się końcowe produkty zaawansowanej glikacji

Powszechnie stosuje się cztery instrumenty i odpowiadają one na różne pytania.

Metoda	Co jest raportowane	Typowe jednostki	Główne ograniczenie
ELISA z monoklonalnym przeciwciałem anty-CML	Materiał reagujący z przeciwciałem w próbce	kilojednostki AGE na 100 g	Określa analit poprzez to, z czym wiąże się przeciwciało; nie jest to ilość molowa nazwanego związku
UPLC-MS/MS z rozcieńczeniem izotopów stabilnych	Określone addukty: CML, CEL, MG-H1 i inne	mg lub nmol na 100 g, lub na mg białka	Wymaga wyczerpującej hydrolizy enzymatycznej w przypadku reszt związanych z białkiem; mierzy tylko to, co jest celem oznaczenia
LC/MS z rozcieńczeniem izotopowym hydrolizatów tkankowych	Wiązania krzyżowe, takie jak glukozepan, MODIC, GODIC	pmol na mg kolagenu	Wymaga biopsji tkanki; niedostępne w populacyjnych badaniach osób żyjących
Czytnik autofluorescencji skóry	Ogólna fluorescencja skóry, emisja 420-600 nm	Jednostki umowne autofluorescencji	Niespecyficzne; wiele AGE nie fluoryzuje, a fluoryzują inne fluorofory

Rabbani i Thornalley opisują chromatografię cieczową sprzężoną z tandemową spektrometrią mas w połączeniu z analizą rozcieńczenia izotopowego jako metodę referencyjną do ilościowego oznaczania adduktów glikacji, utleniania i nitracji. Metoda ta charakteryzuje się wysoką czułością i specyficznością oraz umożliwia jednoczesny pomiar wielu adduktów w jednym przebiegu. Wszystko inne jest tylko przybliżeniem.

Opcja nieinwazyjna wymaga szczególnej uwagi. Meerwaldt i współpracownicy zwalidowali czytnik autofluorescencji skóry na podstawie biopsji od 46 pacjentów z cukrzycą i 46 dopasowanych kontroli. Autofluorescencja korelowała z fluorescencją kolagenu, pentosydyną, CML i CEL, ale współczynniki korelacji wynosiły od 0,47 do 0,62. U 32 z 46 pacjentów z cukrzycą wartości znajdowały się powyżej 95% przedziału ufności średniej kontrolnej. Metodę zwalidowano na niepigmentowanej skórze. Korelacja w tym zakresie jest przydatna do rangowania grup i słaba do charakteryzowania osoby.

Co spożycie z dietą pozwala przewidzieć w osoczu, a czego nie

W badaniu CODAM zmierzono stężenie CML, CEL i MG-H1 w osoczu i moczu u 450 uczestników za pomocą UPLC-MS/MS oraz oszacowano spożycie przy użyciu kwestionariusza częstotliwości spożycia pokarmów połączonego z bazą danych żywności opartą na spektrometrii masowej. Wyższe szacowane spożycie każdej z tych substancji wiązało się z wyższym stężeniem odpowiadających im metabolitów wolnych adduktów w osoczu i moczu. W przypadku osocza standaryzowane współczynniki wynosiły 0,253 (95% CI 0,086 do 0,415) dla CML, 0,194 (0,040 do 0,339) dla CEL i 0,223 (0,069 do 0,373) dla MG-H1.

W tej samej pracy związki między AGE z diety a odpowiadającymi im związanymi z białkami adduktami w osoczu nie były istotne. To rozróżnienie ma kluczowe znaczenie. Wolne addukty to małe cząsteczki w drodze do wydalenia przez nerki. Pula związana z białkami to ta, która osadza się na długo żyjących białkach i tworzy między nimi wiązania krzyżowe. Zaobserwowany związek z pierwszą nie jest dowodem dotyczącym drugiej, a luka między nimi to miejsce, w którym większość pewnych twierdzeń o glikacji z dietą po cichu upada.

Często zadawane pytania

Czym jest reakcja Maillarda w organizmie człowieka?

To ta sama chemia nieenzymatycznego brązowienia, która zachodzi w podgrzewanej lub przechowywanej żywności: cukier redukujący kondensuje z wolną grupą aminową białka, ulega przegrupowaniu i odwodnieniu, tworząc pigmenty i produkty usieciowane. Monnier i Cerami zaproponowali w 1981 roku, że długo żyjące białka, takie jak krystaliny soczewki i kolagen skóry, są na nią podatne, ponieważ nie są zastępowane wystarczająco szybko, by jej uniknąć.

Czym jest karboksymetylolizyna i gdzie powstaje?

N-epsilon-(karboksymetylo)lizyna, czyli CML, to stabilny addukt glikacji lizyny (PubChem CID 123800, C8H16N2O4, 204,22 g/mol, CAS 5746-04-3). Powstaje zarówno w organizmie, jak i w podgrzewanych produktach spożywczych, z glukozy oraz w wyniku oksydacyjnego rozpadu cukrów i lipidów. Jej chemiczna stabilność sprawia, że jest najczęściej mierzonym markerem AGE (zaawansowanych produktów glikacji) w tkankach, osoczu, moczu i żywności.

Czy sposób obróbki kulinarnej zmienia zawartość końcowych produktów zaawansowanej glikacji w żywności?

Według pomiarów tak, i to znacząco. W immunoenzymatycznej bazie danych obejmującej 549 pozycji sucha obróbka cieplna zwiększała zawartość AGE ponad 10- do 100-krotnie w stosunku do stanu surowego w różnych kategoriach żywności, natomiast wilgotna obróbka cieplna, krótsze czasy gotowania, niższe temperatury i kwaśne składniki ograniczały powstawanie nowych AGE. Baza danych oparta na spektrometrii mas niezależnie wykazała najwyższe poziomy w przetworzonych w wysokiej temperaturze produktach z orzechów i zbóż oraz w konserwach mięsnych.

Dlaczego dwie dietetyczne bazy danych AGE się różnią?

Ponieważ mierzą coś innego. Baza danych z 2010 roku raportuje materiał reagujący z przeciwciałami w umownych kilojednostkach z testu ELISA opartego na monoklonalnym przeciwciele anty-CML. Baza danych z 2016 roku raportuje ilości molowe trzech nazwanych związków za pomocą UPLC-MS/MS. Żadna z nich nie jest przeskalowaną wersją drugiej i wartości z jednej nie mogą być przekonwertowane na wartości z drugiej.

Czy autofluorescencja skóry jest wiarygodnym pomiarem poziomu AGE?

Jest to przydatny, nieinwazyjny wskaźnik zastępczy o wyraźnych ograniczeniach. Walidacja przeprowadzona na podstawie biopsji skóry wykazała korelację autofluorescencji z fluorescencją związaną z kolagenem, pentozyną, CML i CEL przy współczynnikach od 0,47 do 0,62, a metodę zwalidowano na skórze niepigmentowanej. Wiele AGE nie wykazuje fluorescencji, a inne fluorofory obecne w skórze tak, dlatego sygnał nie jest specyficzny dla glikacji.

Czy dietetyczne AGE zwiększają poziom AGE we krwi?

W badaniu CODAM u 450 uczestników wyższe szacowane spożycie CML, CEL i MG-H1 z dietą wiązało się z wyższymi poziomami wolnych adduktów w osoczu i moczu. Związki z odpowiednimi adduktami białkowymi w osoczu nie były statystycznie istotne. Ponieważ to pula związana z białkami jest kojarzona z tworzeniem wiązań krzyżowych w tkankach, ten wynik zerowy jest równie ważny jak pozytywny.

Czym jest glukozepan i dlaczego ma znaczenie?

Glukozepan to krzyżowe wiązanie lizyny i argininy pochodzące z glukozy (PubChem CID 135565852, C18H32N6O6, 428,5 g/mol). Mierzony metodą spektrometrii mas z rozcieńczeniem izotopowym w kolagenie skóry ludzkiej osiągnął około 2000 pmol/mg w wieku 90 lat w grupie kontrolnej bez cukrzycy i 5000 pmol/mg w cukrzycy, dwa rzędy wielkości powyżej innych oznaczonych ilościowo wiązań krzyżowych w tych samych próbkach.

Bibliografia

Tylko do celów badawczych. Nonsensia dostarcza wzorce analityczne do zastosowań laboratoryjnych i badawczych. Niniejszy artykuł jest publikowany w celach naukowych i edukacyjnych. Nie stanowi on porady medycznej, nie opisuje żadnego zastosowania u ludzi, a nic w nim zawartego nie powinno być odczytywane jako zalecenie podania jakiejkolwiek substancji osobie lub zwierzęciu.

Kategorie: Nauka o długowieczności

Ten artykuł jest częścią naszego przewodnika: Biologia starzenia: cechy charakterystyczne, chemia i co potwierdzają dowody.

Glikacja i końcowe produkty zaawansowanej glikacji