Która metoda analityczna potwierdza tożsamość i czystość?

Wytyczna ICH Q6A dotycząca specyfikacji jednoznacznie stwierdza: „Identyfikacja wyłącznie na podstawie pojedynczego czasu retencji chromatograficznej, na przykład, nie jest uważana za specyficzną”. Jeden pik eluujący w oczekiwanym czasie nie stanowi testu identyfikacyjnego. Jest to jedynie poszlaka, a wytyczna dalej precyzuje, że zazwyczaj akceptowalne są dwie procedury chromatograficzne oparte na różnych zasadach rozdziału lub kombinacje takie jak HPLC z detekcją diodową, HPLC-MS czy GC-MS.

To zdanie zawiera w miniaturze cały temat. „Która metoda analityczna dowodzi tożsamości i czystości” to pytanie źle postawione w liczbie pojedynczej; właściwe pytanie brzmi: która metoda odpowiada na które pytanie szczegółowe i czego każda z nich nie widzi. Ten artykuł przyporządkowuje techniki do pytań, a pogłębione omówienie poszczególnych metod znajduje się w osobnych artykułach tej kategorii.

Która metoda analityczna dowodzi tożsamości, a która dowodzi czystości

Tożsamość i czystość to różne pomiary o różnych sposobach zawodzenia. Tożsamość pyta: czy to jest substancja, za którą się podaje? Czystość pyta: ile materiału stanowi ta substancja i co stanowi resztę? Technika może być doskonała w jednym aspekcie i bezużyteczna w drugim.

Technika	Pytanie, na które odpowiada	Czego nie jest w stanie zobaczyć
HPLC z detekcją UV	Ile składników można rozdzielić i jaki mają udział w całkowitej odpowiedzi detektora	Wszystko bez chromoforu; związki współeluujące; rzeczywisty stosunek mas
GC-MS	Lotne składniki, w tym pozostałości rozpuszczalników, wraz z charakterystycznym wzorcem fragmentacji	Nielotny i termolabilny materiał
NMR (strukturalny)	Konektywność i otoczenie każdego wodoru i węgla	Śladowe zanieczyszczenia poniżej jego możliwości wykrywania; wszystko bez obserwowanego jądra
qNMR	Zawartość bezwzględna w stosunku do certyfikowanego wzorca wewnętrznego	Zanieczyszczenia, których sygnały nakładają się na całkowany obszar
Spektrometria mas	Dokładna masa, rozkład izotopowy, skład pierwiastkowy	Izomery; wszystko, co nie ulega jonizacji w wybranych warunkach
FTIR	Grupy funkcyjne i odcisk palca całej cząsteczki w porównaniu z wzorcem	Skład ilościowy; zanieczyszczenia na niskim poziomie
XRPD	Którą formę krystaliczną przyjmuje substancja stała	Tożsamość chemiczna cząsteczki; faza amorficzna w matrycy krystalicznej poniżej granicy wykrywalności metody
miareczkowanie Karla Fischera	Wyłącznie woda	Inne substancje lotne; zanieczyszczenia organiczne

Wystarczy przeczytać trzecią kolumnę od góry do dołu, by powód stosowania metod ortogonalnych stał się oczywisty. Martwe pola poszczególnych metod nie nakładają się na siebie – i o to właśnie chodzi.

Dlaczego pojedynczy czas retencji nie jest testem identyfikacyjnym

Czas retencji jest właściwością układu chromatograficznego, a nie cząsteczki. Zmienia się on w zależności od partii kolumny, temperatury, składu fazy ruchomej i objętości martwej instrumentu. Co ważniejsze, nie jest on unikalny: wiele strukturalnie różnych związków eluje w tym samym czasie przy jednym zestawie warunków, a blisko spokrewnione analogi są specjalnie zaprojektowane tak, aby były podobne.

ICH Q6A ustawia poprzeczkę celowo wysoko. Testy identyfikacyjne „powinny optymalnie być w stanie odróżnić związki o blisko spokrewnionej strukturze, które mogą być obecne”, i wytyczna podaje spektroskopię w podczerwieni jako przykład testu specyficznego dla substancji. Gdy substancja jest solą – dodaje wytyczna – identyfikacja powinna być specyficzna dla poszczególnych jonów.

ICH Q2(R2), przyjęta 1 listopada 2023 roku, formalizuje sposób wykazywania tej specyficzności. Oferuje trzy drogi: wykazanie braku interferencji, porównanie wyników z procedurą ortogonalną lub – tam, gdzie sama fizyka gwarantuje rozróżnienie – uzasadnienie wynikające z samej technologii. Wytyczna podaje dwa przykłady trzeciego przypadku: „rozdzielczość izotopów w spektrometrii mas” i „przesunięcia chemiczne w spektroskopii NMR”.

Co tak naprawdę mierzy liczba czystości chromatograficznej

Wartość czystości z HPLC z detekcją UV jest domyślnie procentem powierzchni: powierzchnia głównego piku podzielona przez całkowitą scałkowaną powierzchnię, przy jednej długości fali. W tej liczbie ukryte są trzy założenia, a wszystkie trzy mogą zawieść.

Że każdy składnik absorbuje. Związki bez chromoforu UV są niewidoczne. Adnani i współpracownicy, opracowując uniwersalną kwantyfikację dla strukturalnie zróżnicowanych produktów naturalnych, zauważają, że detekcja światła rozproszonego po odparowaniu była historycznie stosowana właśnie dla związków pozbawionych chromoforu UV – luka ta istnieje, ponieważ odpowiedź UV zależy od struktury elektronowej, a nie od ilości obecnego materiału.
Że wszystko absorbuje w jednakowym stopniu. Nie. Dwa zanieczyszczenia o tym samym stężeniu masowym mogą różnić się odpowiedzią o rząd wielkości, dlatego procent powierzchniowy nie jest procentem masowym, chyba że wyznaczono współczynniki odpowiedzi.
Że wszystko uległo elucji. Materiał zatrzymany na kolumnie, eluowany w objętości martwej lub wytrącający się w dozowniku nie wnosi żadnej powierzchni piku, a zatem nie zostaje policzony jako zanieczyszczenie.

Detektory wrażliwe na masę – detektory światła rozproszonego po odparowaniu i detektory aerozolu naładowanego – reagują na masę cząstek, a nie na absorpcję, dzięki czemu wykrywają materiał pozbawiony chromoforów. Ich odpowiedź jest bardziej jednolita niż w przypadku UV, ale również nie jest idealnie jednolita; uniwersalna kalibracja względem strukturalnie zróżnicowanych analitów nadal wiąże się ze znacznym błędem w porównaniu ze wzorcem dopasowanym do związku.

ICH Q3A(R2), wytyczna dotycząca zanieczyszczeń w nowych substancjach leczniczych, opiera się na tej rzeczywistości. Określa ona próg raportowania, próg identyfikacji i próg kwalifikacji oraz definiuje kwalifikację jako „proces pozyskiwania i oceny danych, które ustalają bezpieczeństwo biologiczne pojedynczego zanieczyszczenia lub określonego profilu zanieczyszczeń na określonym poziomie (poziomach)”. Te progi skalują się z maksymalną dzienną dawką substancji; dokładne zakresy są wymienione w Załączniku 1 do wytycznej i nie są tu powtarzane. Kluczowy punkt jest taki, że zanieczyszczenie powyżej progu identyfikacji musi być zidentyfikowane, a nie jedynie scałkowane – czego sama chromatografia nie może dokonać.

Co może, a czego nie może rozstrzygnąć spektrometria mas

Wysokorozdzielcza spektrometria mas dostarcza dokładnej masy, na podstawie której można stworzyć krótką listę możliwych składów pierwiastkowych. Kuszące jest potraktowanie tego jako identyfikacji. Kind i Fiehn przetestowali to założenie bezpośrednio, a powstały artykuł zatytułowali „Mass accuracy is insufficient even at less than 1 ppm”.

Ich ustalenie jest takie, że wraz ze wzrostem masy cząsteczkowej sama dokładna masa pozostawia zbyt wiele kandydujących wzorów sumarycznych, a listę zawęża dopiero ograniczenie wynikające z rozkładu względnej zawartości izotopów: „zastosowanie takiego ortogonalnego filtra powyżej 500 u zawsze usuwa ponad 95% fałszywych kandydatów”. Ich wniosek jest jeszcze dosadniejszy – przyrząd o dokładności masy 3 ppm i 2% błędu w rozkładach izotopowych przewyższa przyrząd o dokładności lepszej niż 1 ppm, który ignoruje informację izotopową.

Wynikają z tego dwa ograniczenia. Po pierwsze, wzór sumaryczny nie jest strukturą. Po drugie – i to dotkliwiej dla każdego, kto porównuje widmo z bazą danych – izomery mają dokładnie ten sam wzór. Spektrometria mas nie może ich odróżnić na podstawie masy, a jedynie na podstawie fragmentacji lub rozdziału chromatograficznego przed wlotem do spektrometru.

Dlaczego qNMR i bilans masy weryfikuje się wzajemnie

Ilościowa spektroskopia NMR zajmuje nietypową pozycję. Natężenie sygnału jest proporcjonalne do liczby jąder, które go generują, dzięki czemu można mierzyć czystość w odniesieniu do certyfikowanego wewnętrznego wzorca, który nie musi być analitem. Eliminuje to błędne koło chromatografii polegające na konieczności posiadania czystej próbki substancji, którą próbuje się zmierzyć.

Sprawdzono to w międzynarodowym badaniu międzylaboratoryjnym z udziałem trzynastu laboratoriów. Trzy próbki, każda certyfikowana konwencjonalną metodą pierwszorzędową – bilans masy, miareczkowanie kulometryczne oraz obniżenie temperatury krzepnięcia w połączeniu z qNMR – zostały zmierzone za pomocą protonowego qNMR z kalibracją wewnętrzną. Zmierzone wartości były równoważne wartościom referencyjnym podanym dla próbek, a autorzy stwierdzili, że qNMR „ma kompetencje do uzyskania takiej samej wydajności i dokładności kwantyfikacji jak konwencjonalne pierwszorzędowe metody pomiarowe”.

Równoważność nie jest redundancją. Davies i współpracownicy z australijskiego National Measurement Institute porównali qNMR z bilansem masy na organicznych wzorcach kalibracyjnych o różnej złożoności strukturalnej, a ich argument za stosowaniem obu metod jest konkretny: wykazana zgodność między dwiema niezależnymi wartościami czystości potwierdza dokładność i minimalizuje „możliwość ukrytego obciążenia”. Ukryte obciążenie to dokładnie ten rodzaj błędu, którego pojedyncza metoda nie może zgłosić, ponieważ metoda jest na niego ślepa z konstrukcji.

Testy, których chromatografia nigdy nie widzi: woda, rozpuszczalniki i forma stała

Trzy atrybuty stałego materiału odniesienia są niewidoczne dla chromatogramu czystości, a każdy z nich ma swoją własną technikę.

Woda. ICH Q6A traktuje zawartość wody jako osobne badanie, istotne gdy substancja jest higroskopijna, ulega degradacji pod wpływem wilgoci lub jest hydratem stechiometrycznym. Ubytek masy po suszeniu może być wystarczający w niektórych przypadkach, ale wytyczna stwierdza, że „preferowana jest procedura wykrywania specyficzna dla wody (np. miareczkowanie Karla Fischera)”. Różnica ma znaczenie: ubytek masy po suszeniu obejmuje wszystko, co lotne, podczas gdy miareczkowanie Karla Fischera oznacza wodę, a nie na przykład pozostałości etanolu.

Pozostałości rozpuszczalników. ICH Q3C(R9), obowiązująca od 24 stycznia 2024 r., stwierdza, że rozpuszczalniki „nie są całkowicie usuwane przez praktyczne techniki produkcyjne” oraz że „nie ma korzyści terapeutycznych z pozostałości rozpuszczalników”. Dzieli je na trzy klasy ze względu na zagrożenie: Klasa 1, której należy unikać, obejmująca znane lub silnie podejrzewane kancerogeny dla ludzi i zagrożenia dla środowiska; Klasa 2, którą należy ograniczać, obejmująca niegenotoksyczne kancerogeny zwierzęce oraz czynniki innej nieodwracalnej toksyczności; Klasa 3, o niskim potencjale toksycznym, dla której wytyczna stwierdza, że nie jest potrzebny limit narażenia oparty na kryteriach zdrowotnych. W kwestii metody wytyczna wypowiada się wprost: pozostałości rozpuszczalników „są zwykle oznaczane za pomocą technik chromatograficznych, takich jak chromatografia gazowa”, przy czym dopuszczalna jest niespecyficzna metoda, taka jak ubytek masy po suszeniu, gdy obecne są tylko rozpuszczalniki Klasy 3 i metoda jest odpowiednio zwalidowana.

Postać stała. Polimorfy są tym samym związkiem chemicznym w różnych upakowaniach krystalicznych i mogą różnić się właściwościami fizycznymi, pozostając jednocześnie nieodróżnialne chemicznie. ICH Q6A wymienia techniki stosowane do ustalenia, czy istnieje wiele form: temperatura topnienia z mikroskopią ze stolikiem grzewczym, podczerwień w stanie stałym, proszkowa dyfrakcja rentgenowska, metody termiczne takie jak DSC, TGA i DTA, spektroskopia Ramana, mikroskopia optyczna i NMR w stanie stałym. Analiza HPLC rozpuszcza próbkę, niszcząc dokładnie te informacje, które metody te mają na celu uchwycić.

Ortogonalność jest wymaganiem regulacyjnym, a nie preferencją

Słowo „ortogonalny” pojawia się w całej ICH Q2(R2) jako zdefiniowane narzędzie, a nie ozdobnik stylistyczny. Specyficzność można zweryfikować „wykazując, że zmierzony wynik analitu jest porównywalny ze zmierzonym wynikiem drugiej, dobrze scharakteryzowanej procedury analitycznej, która najlepiej stosuje inną zasadę pomiaru”. W przypadku dokładności procedury ortogonalne „mogą być stosowane przy ilościowych pomiarach zanieczyszczeń do weryfikacji pierwotnych wartości pomiarowych” tam, gdzie badania z dodatkiem wzorca są niemożliwe, bo odpowiednich zanieczyszczeń nie da się uzyskać.

Ostatni fragment opisuje typową sytuację dla materiału odniesienia. Jeśli zanieczyszczenia nie można wyizolować, nie można go również dodać do próbki, a pojedyncza metoda nie ma sposobu, by udowodnić, że byłaby w stanie je wykryć. Druga metoda, działająca na innej zasadzie fizycznej, jest jedyną dostępną kontrolą.

W praktyce oznacza to niewielki zestaw testów dobranych w taki sposób, aby ich martwe pola nie pokrywały się: separacja w celu uzyskania profilu, metoda spektroskopowa do identyfikacji, metoda niezależna od masy do oznaczenia zawartości, specyficzne oznaczenie zawartości wody, metoda oznaczania substancji lotnych dla rozpuszczalników oraz – w przypadku krystalicznego ciała stałego, gdy forma ma znaczenie – dyfraktogram. Świadectwo analizy podające jedną liczbę z jednego instrumentu nie opisuje materiału; opisuje ono punkt widzenia tego instrumentu.

Które wątki ta kategoria rozwija osobno

Ta strona pełni funkcję węzła i celowo zatrzymuje się w tym miejscu. Jak czytać świadectwo analizy wiersz po wierszu, co faktycznie stwierdzają procent powierzchniowy i bilans masy, jak wyznacza się względne współczynniki odpowiedzi, jak opracowuje się metodę wskazującą stabilność i poddaje ją badaniom degradacji wymuszonej oraz szczegóły operacyjne poszczególnych technik – każde z tych zagadnień omówiono na osobnej stronie tej kategorii. Chemia pochodzenia samych związków należy do kategorii odkryć, a nie do tej. Nic na tej stronie nie jest zaleceniem dotyczącym stosowania; warunki, na jakich te substancje są dostarczane do pracy laboratoryjnej, określono w zasadach strony.

Często zadawane pytania

Dlaczego pojedynczy czas retencji w chromatografii cieczowej (HPLC) nie jest dowodem na tożsamość substancji?

Ponieważ czas retencji jest właściwością układu chromatograficznego, a nie cząsteczki, i nie jest unikalny. ICH Q6A stwierdza, że identyfikacja wyłącznie na podstawie pojedynczego czasu retencji chromatograficznej nie jest uważana za specyficzną. Wytyczna akceptuje dwie procedury chromatograficzne rozdzielające na różnych zasadach lub kombinacje takie jak HPLC-MS lub GC-MS jako ogólnie akceptowalne alternatywy.

Co właściwie oznacza 99% czystości według HPLC?

Zwykle oznacza to procent powierzchni: pole powierzchni głównego piku jako ułamek całkowitej wykrytej powierzchni przy jednej długości fali. Nie jest to ułamek masowy. Wartość ta zakłada, że każdy składnik pochłania przy tej długości fali, że wszystkie składniki dają jednakową odpowiedź i że wszystko, co zostało wprowadzone, zostało eluowane. Wszystkie trzy założenia mogą zawieść niepostrzeżenie.

Dlaczego detekcja UV pomija zanieczyszczenia bez chromoforu?

Absorpcja ultrafioletowa zależy od struktury elektronowej, a nie od ilości obecnego materiału. Związek bez układu sprzężonego lub odpowiedniej grupy funkcyjnej pochłania w sposób pomijalny przy analitycznej długości fali i nie tworzy piku, niezależnie od stężenia. Detektory czułe na masę, takie jak detektory światła rozproszonego po odparowaniu lub detektory aerozolu naładowanego, reagują natomiast na masę cząstek i dlatego rejestrują materiał wolny od chromoforu.

Czy spektrometria mas może odróżnić izomery?

Nie na podstawie samej masy. Izomery mają dokładnie taki sam skład pierwiastkowy, więc mają tę samą masę dokładną. Kind i Fiehn wykazali, że nawet dokładność masy poniżej części na milion pozostawia wiele kandydatów na wzory, a rozkłady względnej zawartości izotopów usuwają ponad 95% fałszywych kandydatów powyżej 500 u. Oddzielenie izomerów wymaga chromatografii przed wprowadzeniem próbki lub analizy fragmentacji po nim.

Co to jest ortogonalna procedura analityczna?

To druga, dobrze scharakteryzowana procedura, która najlepiej stosuje inną zasadę pomiaru niż pierwsza. ICH Q2(R2) akceptuje porównanie z taką procedurą jako sposób wykazania specyficzności oraz jako sposób weryfikacji dokładności pomiarów zanieczyszczeń, gdy odpowiednich zanieczyszczeń nie da się uzyskać do badań z dodatkiem wzorca. Inna zasada oznacza inne martwe pola.

Dlaczego qNMR może mierzyć czystość bez wzorca tego samego związku?

Ponieważ intensywność sygnału NMR jest proporcjonalna do liczby jąder go wytwarzających, certyfikowany wzorzec wewnętrzny dowolnej odpowiedniej substancji kalibruje pomiar. Międzynarodowe badanie międzylaboratoryjne z udziałem trzynastu laboratoriów wykazało, że wyniki protonowego qNMR są równoważne wartościom certyfikowanym metodami bilansu masy, miareczkowania kulometrycznego i obniżenia temperatury krzepnięcia, a autorzy stwierdzili, że qNMR dorównuje konwencjonalnym pierwszorzędowym metodom ilościowym.

Która metoda wykrywa pozostałości rozpuszczalników w substancji leczniczej?

Chromatografia gazowa. ICH Q3C(R9) stwierdza, że pozostałości rozpuszczalników są zazwyczaj określane za pomocą technik chromatograficznych, takich jak chromatografia gazowa. Metoda niespecyficzna, taka jak ubytek masy po suszeniu, jest akceptowalna tylko wtedy, gdy oczekuje się wyłącznie rozpuszczalników klasy 3 i metoda ta została odpowiednio zwalidowana. Wytyczna klasyfikuje rozpuszczalniki na trzy klasy zagrożenia.

Co mówi proszkowa dyfrakcja rentgenowska, czego nie powie HPLC?

Jaką formę krystaliczną ma substancja stała. Polimorfy to ta sama cząsteczka upakowana inaczej, więc są chemicznie identyczne i nie można ich rozróżnić chromatograficznie po rozpuszczeniu. ICH Q6A wymienia proszkową dyfrakcję rentgenowską obok spektroskopii IR w stanie stałym, analizy termicznej, spektroskopii Ramana i NMR w stanie stałym jako techniki używane do określenia, czy istnieją różne formy.

Bibliografia

Tylko do celów badawczych. Nonsensia dostarcza wzorce analityczne do zastosowań laboratoryjnych i badawczych. Niniejszy artykuł jest publikowany w celach naukowych i edukacyjnych. Nie stanowi on porady medycznej, nie opisuje żadnego zastosowania u ludzi, a nic w nim zawartego nie powinno być odczytywane jako zalecenie podania jakiejkolwiek substancji osobie lub zwierzęciu.

Kategorie: Metody analityczne

Nonsensia dostarcza omawiane w tym przewodniku związki jako wzorce analityczne do użytku laboratoryjnego i badawczego.

Tożsamość i czystość: kompletny przewodnik po metodach analitycznych dla małych cząsteczek