Na tej samej półce stoją dwie butelki. Obie są oznaczone tą samą nazwą związku, obie mają czystość na poziomie dziewięćdziesięciu dziewięciu procent lub wyższą i dołączoną dokumentację. Jednej można użyć do kalibracji metody, której wynik zostanie przedstawiony w dokumentacji regulacyjnej. Drugiej nie można. Różnica między wzorcem analitycznym a odczynnikiem nie polega na klasie, cenie czy poziomie czystości; chodzi o to, co dokładnie stwierdza dołączona dokumentacja i kto stoi za tym stwierdzeniem.
Ten przewodnik porządkuje terminologię, od której zależy ta różnica: materiał odniesienia i certyfikowany materiał odniesienia w rozumieniu międzynarodowej metrologii, spójność pomiarowa i łańcuch wzorcowania, niepewność pomiaru i współczynniki rozszerzenia, co oznacza słowo "pierwotny", gdy używa go metrolog, do czego służy norma ISO 17034 oraz dlaczego laboratorium miałoby celowo kupować niewielką ilość zanieczyszczenia.
Jaka jest różnica między wzorcem analitycznym a odczynnikiem?
Punktem wyjścia jest definicja, od której zależy większość pozostałych. Międzynarodowy słownik metrologii, wydany jako JCGM 200:2012 i bezpłatnie dostępny do pobrania ze strony BIPM, definiuje w haśle 5,13 materiał odniesienia jako materiał wystarczająco jednorodny i stabilny ze względu na określone właściwości, dla którego ustalono, że jest przydatny do zamierzonego zastosowania w pomiarach lub w badaniu właściwości nominalnych.
Kluczowe są tu trzy warunki: jednorodność, stabilność i wykazana przydatność do określonego celu. Odczynnik kupuje się ze względu na to, co robi w kolbie. Materiał odniesienia kupuje się ze względu na to, co pozwala analitykowi stwierdzić o wyniku liczbowym. Czystość jest do tej drugiej roli konieczna, ale sama w sobie niewystarczająca, ponieważ wartości bez udokumentowanej podstawy nie da się obronić.
Ten sam słownik zawiera uwagę, o którą laboratoria regularnie się potykają: materiały odniesienia z przypisanymi wartościami wielkości lub bez nich mogą być stosowane do kontroli precyzji pomiaru, natomiast do kalibracji lub kontroli poprawności pomiaru mogą być stosowane wyłącznie materiały odniesienia z przypisanymi wartościami wielkości. Materiał bez przypisanej wartości wciąż może powiedzieć analitykowi, czy metoda jest powtarzalna. Nie powie mu jednak, czy metoda daje prawidłowy wynik.
| Materiał | Co stwierdza dokumentacja | Co potwierdza |
|---|---|---|
| Odczynnik lub produkt techniczny | Tożsamość i wartość czystości podana przez producenta, przy użyciu metody własnej producenta | Synteza, oczyszczanie, niekrytyczne przygotowanie |
| Materiał odniesienia (RM) | Jednorodność i stabilność dla określonych właściwości, przydatność do zamierzonego użycia | Kontrola precyzji, przydatność systemu, tożsamość jakościowa |
| Certyfikowany materiał odniesienia (CRM) | Jedna lub więcej wartości właściwości z przypisanymi niepewnościami i spójnościami pomiarowymi, w dokumentacji wydanej przez uprawniony organ z zastosowaniem prawidłowych procedur | Kalibracja, kontrola poprawności, walidacja metody, sporne wyniki |
Co certyfikowany materiał odniesienia wnosi, czego nie wnosi zwykły materiał odniesienia
JCGM 200:2012 definiuje w haśle 5,14 certyfikowany materiał odniesienia jako materiał odniesienia z dokumentacją wydaną przez uprawniony organ, podającą jedną lub więcej określonych wartości właściwości wraz z niepewnościami i spójnościami pomiarowymi, uzyskanymi z zastosowaniem prawidłowych procedur. Słownik zaznacza, że dokumentację tę podaje się w formie certyfikatu.
Każdy element tej definicji jest wymogiem i każdy to pytanie warte zadania dostawcy. Która wartość właściwości jest certyfikowana i czy to ta, której się używa? Jaka jest podana niepewność tej wartości? Z czym ta wartość jest spójna pomiarowo? Który organ wydał dokument i na jakiej podstawie jest on uprawniony? Świadectwo analizy, które podaje wartość czystości chromatograficznej bez niepewności i bez deklaracji spójności pomiarowej, to sprawozdanie z badań. Jest to przydatny dokument, ale nie jest to certyfikat w tym sensie, a traktowanie ich jako równoważnych jest najczęstszym błędem kategorialnym w tej dziedzinie.
Pomaga tu spojrzenie na skalę. National Institute of Standards and Technology podaje, że certyfikuje i udostępnia ponad 1200 materiałów Standard Reference Materials o dobrze scharakteryzowanym składzie lub właściwościach albo jednym i drugim. Taki jest rozmiar wierzchołka piramidy w jednym krajowym instytucie metrologicznym, we wszystkich dziedzinach pomiarów, co mówi analitykowi coś użytecznego: dla większości konkretnych analitów organicznych nie istnieje żaden CRM krajowego instytutu, a praktycznym pytaniem staje się to, jak dobrze scharakteryzowany i udokumentowany jest dostępny materiał.
Co oznacza spójność pomiarowa w analizie chemicznej
Spójność pomiarowa to właściwość, która wiąże wynik laboratoryjny z czymś spoza laboratorium. JCGM 200:2012, hasło 2,41, definiuje metrologiczną spójność pomiarową jako właściwość wyniku pomiaru, dzięki której wynik ten można powiązać z odniesieniem poprzez udokumentowany, nieprzerwany łańcuch kalibracji, z których każda wnosi udział do niepewności pomiaru. Uwagi dodają, że odniesieniem może być jednostka miary w jej praktycznej realizacji, procedura pomiarowa lub wzorzec pomiarowy oraz że spójność pomiarowa wymaga ustalonej hierarchii kalibracji.
Hasło 2,40 definiuje tę hierarchię jako sekwencję kalibracji od odniesienia do końcowego systemu pomiarowego, w której wynik każdej kalibracji zależy od wyniku poprzedniej. Pierwsza uwaga do tego hasła to zdanie, które każdy nabywca wzorców powinien znać na pamięć:
Niepewność pomiaru nieuchronnie wzrasta wzdłuż sekwencji kalibracji.
Niepewność rośnie monotonicznie w dół łańcucha. Nigdy nie maleje. Wzorzec roboczy skalibrowany względem wzorca wtórnego, który z kolei skalibrowano względem wzorca państwowego, przenosi wszystkie trzy składniki niepewności. Dlatego deklaracja spójności pomiarowej bez podanej niepewności w ogóle nie jest deklaracją, a krótki, udokumentowany łańcuch jest wart więcej niż imponująco brzmiący, lecz nieudokumentowany.
Jaka jest różnica między pierwotnymi a wtórnymi wzorcami analitycznymi?
W metrologii termin 'pierwotny' jest określeniem technicznym, a nie marketingowym przymiotnikiem. Zgodnie z JCGM 200:2012, hasło 5,4, pierwotny wzorzec pomiarowy to wzorzec pomiarowy ustanowiony z zastosowaniem pierwotnej referencyjnej procedury pomiarowej lub utworzony jako artefakt wybrany na zasadzie umowy. Hasło 2,8 definiuje pierwotną referencyjną procedurę pomiarową jako referencyjną procedurę pomiarową stosowaną do uzyskania wyniku pomiaru bez odniesienia do wzorca pomiarowego wielkości tego samego rodzaju.
To ostatnie sformułowanie warto przeczytać powoli, bo zawiera całą różnicę. Procedura pierwotna nie potrzebuje wzorca tej samej wielkości, aby wyznaczyć swoją wartość; opiera się na niezależnie zmierzonych wielkościach. Przykład podany w samym słowniku to pierwotny wzorzec stężenia ilości substancji, przygotowany przez rozpuszczenie znanej ilości substancji składnika chemicznego w znanej objętości roztworu. Masę i objętość się mierzy; stężenie jest wyliczane.
Wtórny wzorzec z kolei uzyskuje swoją wartość poprzez porównanie z innym wzorcem tego samego rodzaju. Nie ma w tym nic złego, a większość laboratoriów na co dzień pracuje ze wzorcami wtórnymi i roboczymi. Chodzi o to, że słowo 'pierwotny' ma określone znaczenie, a gdy dostawca go używa, zasadne jest pytanie, którą definicję ma na myśli i jaka procedura przypisała wartość.
Zakres normy ISO 17034 opisany na podstawie źródeł wtórnych
Należy się tu wyraźne zastrzeżenie. Normy ISO są sprzedawane, a nie publikowane w otwartym dostępie, i podczas pisania tego przewodnika nie korzystano z tekstu normy ISO 17034:2016. Dalszy opis opiera się na recenzowanym artykule w Accreditation and Quality Assurance napisanym przez autorów zaangażowanych w opracowanie normy. Nie cytuje się tu żadnego postanowienia normy i nic w tym tekście nie powinno być traktowane jako zamiennik samej normy.
Według tej pracy ISO 17034:2016 określa ogólne wymagania dotyczące kompetencji producentów materiałów odniesienia i zastępuje ISO Guide 34:2009, opracowany przez Komitet ISO ds. Materiałów Odniesienia, znany jako REMCO. Przejście od przewodnika do normy wynikało z praktycznego problemu: kilka jednostek akredytujących w ogóle nie mogło akredytować według przewodnika, a w innych krajach ISO Guide 34 mógł służyć jako norma akredytacyjna tylko w połączeniu z ISO/IEC 17025. Przekształcenia dokonała wspólna grupa robocza REMCO i Komitetu ISO ds. Oceny Zgodności, CASCO, która dostosowała strukturę do reszty serii ISO/IEC 17000. Praca stwierdza, że wymagania dotyczące wytwarzania materiałów odniesienia opracowano wyraźniej, określając wymagania dla niecertyfikowanych materiałów odniesienia i dodatkowe wymagania dla certyfikowanych.
Konsekwencja praktyczna dla nabywcy jest wąska i warto ją wyrazić precyzyjnie. Akredytacja na zgodność z ISO 17034 to stwierdzenie dotyczące kompetencji producenta i spójności jego działania, oceniane przez stronę trzecią. Nie jest to gwarancja dla każdej partii i nie zastępuje lektury świadectwa analizy konkretnej partii, którą ma się w ręku. Zapisy w warunkach handlowych dostawców, w tym naszych, opisują warunki dostawy; nie stanowią oceny zgodności.
Co oznacza współczynnik rozszerzenia k równy 2 w certyfikacie
Niepewność w certyfikacie podaje się zwykle jako niepewność rozszerzoną. Przewodnik wyrażania niepewności pomiaru, JCGM 100:2008, opisuje to w punkcie 3.3.7: niepewność rozszerzoną otrzymuje się, mnożąc złożoną niepewność standardową przez współczynnik rozszerzenia, aby uzyskać przedział, który, jak się oczekuje, obejmuje dużą część rozkładu wartości, które można w uzasadniony sposób przypisać wielkości mierzonej. Przewodnik stwierdza, że współczynnik rozszerzenia mieści się zwykle w zakresie od 2 do 3 i że zawsze należy go podawać.
Dla typowego przypadku przewodnik jest precyzyjny. Gdy rozkład scharakteryzowany przez wynik i jego złożoną niepewność standardową jest w przybliżeniu normalny, a efektywna liczba stopni swobody jest dostatecznie duża, można przyjąć, że współczynnik rozszerzenia 2 daje przedział o poziomie ufności około 95%, a współczynnik rozszerzenia 3 około 99%. Do tego zdania dołączone są dwa warunki. Certyfikat, który podaje przedział bez podania współczynnika rozszerzenia, pomija informację, której podanie przewodnik uznaje za obowiązkowe.
Dlaczego laboratoria kupują wzorce zanieczyszczeń
Zakup ilości rzędu miligramów związku, którego nikt nie chce mieć w swoim produkcie, wydaje się dziwactwem, dopóki na stole nie pojawi się arytmetyka regulacyjna. Wytyczna ICH Q3A(R2) dotycząca zanieczyszczeń w nowych substancjach czynnych, aktualna wersja z etapu 4 z dnia 25 października 2006 r., określa trzy progi, które zależą od maksymalnej dawki dobowej substancji czynnej.
| Maksymalna dawka dobowa | Próg raportowania | Próg identyfikacji | Próg kwalifikacji |
|---|---|---|---|
| Nie więcej niż dwa gramy dziennie | 0,05% | 0,10% lub 1,0 mg dobowego przyjęcia, w zależności od tego, która wartość jest niższa | 0,15% lub 1,0 mg dobowego przyjęcia, w zależności od tego, która wartość jest niższa |
| Powyżej dwóch gramów dziennie | 0,03% | 0,05% | 0,05% |
Wytyczna definiuje próg identyfikacji jako granicę, powyżej której zanieczyszczenie należy zidentyfikować, a próg kwalifikacji jako granicę, powyżej której zanieczyszczenie należy zakwalifikować, przy czym kwalifikacja oznacza pozyskanie i ocenę danych potwierdzających bezpieczeństwo biologiczne danego zanieczyszczenia lub profilu zanieczyszczeń na określonym poziomie. Stwierdza również, że granica oznaczalności procedury analitycznej nie powinna przekraczać progu raportowania. Przekroczenie progu na poziomie jednej dziesiątej procenta uruchamia zatem prace nad ustaleniem struktury, a przekroczenie kolejnego progu — prace nad oceną bezpieczeństwa.
Q3A(R2) jednoznacznie określa rolę wzorców w tym kontekście. Zawartość zanieczyszczeń organicznych można mierzyć technikami porównującymi odpowiedź analityczną zanieczyszczenia albo z odpowiedzią odpowiedniego wzorca analitycznego, albo z odpowiedzią samej substancji czynnej. Wzorce stosowane do kontroli zanieczyszczeń powinny być oceniane i charakteryzowane zgodnie z ich zamierzonym zastosowaniem. Wytyczna dopuszcza użycie substancji czynnej jako wzorca, ale dodaje istotny warunek: jeśli współczynniki odpowiedzi substancji czynnej i zanieczyszczenia nie są zbliżone, praktyka ta może być nadal właściwa, pod warunkiem że zastosuje się współczynnik korekcyjny albo że zanieczyszczenia są w rzeczywistości przeszacowywane.
To cała komercyjna logika wzorców zanieczyszczeń w jednym akapicie. Bez wyizolowanego zanieczyszczenia analityk zakłada równoważną odpowiedź detektora. Mając je, współczynnik odpowiedzi się mierzy zamiast go zakładać, a założenie znika z dokumentacji rejestracyjnej.
Jak przypisuje się czystość i dlaczego procent powierzchni piku nie jest ułamkiem masowym
Wartość czystości jest wynikiem metody, a nie właściwością butelki. Normalizacja powierzchni pików w chromatografii podaje udział wykrytego sygnału przypisywany głównemu pikowi, co jest wielkością inną niż ułamek masowy związku w materiale. Wszystko, czego detektor nie widzi, nie trafia do mianownika.
Ilościowa spektroskopia rezonansu magnetycznego jądrowego to typowe rozwiązanie ortogonalne. Przegląd z 2014 roku w Journal of Medicinal Chemistry dowodzi, że rzetelny opis budowy chemicznej wymaga uwzględnienia zarówno struktury, jak i czystości, oraz że w porównaniu z chromatografią i analizą elementarną ilościowy NMR wykorzystuje niemal uniwersalną detekcję i stanowi wszechstronne oraz ortogonalne narzędzie oceny czystości. Autorzy zwracają szczególną uwagę na to, że absolutny ilościowy NMR z elastyczną kalibracją obejmuje anality, które często umykają detekcji, wymieniając wodę i sorbenty, oraz że ten tok postępowania daje jednocześnie możliwości jakościowe i ilościowe.
Praktyczny wniosek: dwie metody odpowiadające na to samo pytanie w oparciu o różne zjawiska fizyczne to sposób, w jaki wartość czystości zyskuje wiarygodność. Jedna liczba z chromatogramu, niezależnie od tego, jak imponująco wiele ma miejsc po przecinku, nie odróżni czystego związku od związku, któremu towarzyszy coś, na co detektor jest ślepy.
Często zadawane pytania
Jaka jest różnica między wzorcem analitycznym a odczynnikiem?
Właściwości odczynnika określa się pod kątem tego, co robi w reakcji; wzorzec analityczny charakteryzuje się tak, aby zmierzoną wartość dało się obronić. Międzynarodowa metrologia definiuje materiał odniesienia jako wystarczająco jednorodny i stabilny ze względu na określone właściwości oraz uznany za przydatny do zamierzonego zastosowania w pomiarach. Sama wartość czystości nie spełnia tej definicji.
Co zapewnia certyfikowany materiał odniesienia, czego nie zapewnia materiał odniesienia?
Dokument wydany przez uprawniony organ, podający jedną lub więcej określonych wartości właściwości z przypisanymi niepewnościami i spójnościami pomiarowymi, opracowany z zastosowaniem prawidłowych procedur. Taka jest definicja w JCGM 200:2012. Świadectwo analizy podające wartość czystości bez niepewności i bez deklaracji spójności pomiarowej jest sprawozdaniem z badań, a nie certyfikatem w tym sensie.
Dlaczego niepewność pomiaru rośnie wzdłuż łańcucha kalibracji?
Ponieważ każda kalibracja w hierarchii zależy od wyniku poprzedniej i każda wnosi własny składnik niepewności. Międzynarodowy słownik metrologii stwierdza wprost, że niepewność pomiaru nieuchronnie rośnie wzdłuż sekwencji kalibracji. Niepewność wzorca roboczego nigdy więc nie może być mniejsza niż niepewność odniesienia, od którego on pochodzi.
Co oznacza współczynnik rozszerzenia k równy 2 w certyfikacie?
Oznacza, że podana niepewność rozszerzona jest dwukrotnością złożonej niepewności standardowej. Gdy rozkład jest w przybliżeniu normalny, a efektywna liczba stopni swobody jest dostatecznie duża, przewodnik dotyczący niepewności stwierdza, że daje to przedział o poziomie ufności około 95 procent. Współczynnik rozszerzenia należy zawsze podawać w certyfikacie.
Czy akredytacja ISO 17034 gwarantuje materiał w butelce?
Nie. Jest to dokonywana przez stronę trzecią ocena kompetencji producenta i spójności jego działania jako wytwórcy materiałów odniesienia. Według literatury wtórnej ISO 17034:2016 zastąpiła ISO Guide 34:2009 i określa wymagania dotyczące materiałów odniesienia oraz dodatkowe wymagania dla materiałów certyfikowanych. Certyfikat konkretnej partii i tak trzeba przeczytać.
Dlaczego laboratorium miałoby kupować wzorzec zanieczyszczeń?
Aby zmierzyć współczynnik odpowiedzi zamiast go zakładać. ICH Q3A(R2) pozwala oszacować zanieczyszczenie względem samej substancji czynnej, ale wymaga współczynnika korekcyjnego, gdy współczynniki odpowiedzi nie są zbliżone. Progi identyfikacji i kwalifikacji zaczynają się dla wielu produktów od jednej dziesiątej procenta, więc błędnie przyjęty współczynnik odpowiedzi może przesunąć wynik na drugą stronę progu regulacyjnego.
Czy 99,9% czystości oznaczonej metodą HPLC oznacza 99,9% czystości masowej?
Nie. Normalizacja powierzchni pików w chromatografii opisuje wykryty sygnał, więc wszystko, czego detektor nie widzi, np. woda, pozostałości rozpuszczalnika czy pozostałości nieorganiczne, jest pomijane w obliczeniach. Ilościowa spektroskopia NMR jest często stosowana jako kontrola ortogonalna, ponieważ zapewnia niemal uniwersalną detekcję i przy kalibracji absolutnej wykrywa indywidua chemiczne, które umykają detekcji chromatograficznej.
Co oznacza termin 'pierwotny' w kontekście pierwotnego wzorca analitycznego?
W metrologii oznacza to, że wartość ustalono z zastosowaniem pierwotnej referencyjnej procedury pomiarowej, zdefiniowanej jako procedura dająca wynik bez odniesienia do wzorca pomiarowego wielkości tego samego rodzaju, albo że wzorzec jest artefaktem wybranym na zasadzie umowy. Wzorzec wtórny uzyskuje swoją wartość przez porównanie z innym wzorcem tej samej wielkości.
Bibliografia
- JCGM 200:2012, International Vocabulary of Metrology (VIM), 3rd edition. BIPM Joint Committee for Guides in Metrology
- JCGM 100:2008, Evaluation of measurement data: Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement. BIPM Joint Committee for Guides in Metrology
- Trapmann S, Botha A, Linsinger TPJ, Mac Curtain S, Emons H. The new International Standard ISO 17034: general requirements for the competence of reference material producers. Accreditation and Quality Assurance, 2017;22:381-387
- ICH Harmonised Tripartite Guideline Q3A(R2), Impurities in New Drug Substances, step 4 version dated 25 October 2006
- Pauli GF, Chen SN, Simmler C, Lankin DC, Godecke T, Jaki BU. Importance of Purity Evaluation and the Potential of Quantitative 1H NMR as a Purity Assay. Journal of Medicinal Chemistry, 2014;57:9220-9231
- Standard Reference Materials. National Institute of Standards and Technology
Tylko do celów badawczych. Nonsensia dostarcza wzorce analityczne do zastosowań laboratoryjnych i badawczych. Niniejszy artykuł jest publikowany w celach naukowych i edukacyjnych. Nie stanowi on porady medycznej, nie opisuje żadnego zastosowania u ludzi, a nic w nim zawartego nie powinno być odczytywane jako zalecenie podania jakiejkolwiek substancji osobie lub zwierzęciu.
Kategorie: Wzorce analityczne
Nonsensia dostarcza omawiane w tym przewodniku związki jako wzorce analityczne do użytku laboratoryjnego i badawczego.