{"id":11738,"date":"2026-10-30T10:38:25","date_gmt":"2026-10-30T10:38:25","guid":{"rendered":"https:\/\/nonsensia.pl\/?p=11738"},"modified":"2026-10-21T07:56:53","modified_gmt":"2026-10-21T07:56:53","slug":"hplc-purity-number-area-normalisation","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/nonsensia.pl\/pl\/2026\/10\/30\/hplc-purity-number-area-normalisation\/","title":{"rendered":"Co naprawd\u0119 mierzy wynik czysto\u015bci HPLC"},"content":{"rendered":"<p>Chromatogram to wykres sygna\u0142u detektora w funkcji czasu. Nie jest to wykres masy w funkcji czasu. Prawie ka\u017cde nieporozumienie dotycz\u0105ce czysto\u015bci tkwi w luce mi\u0119dzy tymi dwoma zdaniami.<\/p>\n<p>Co zatem oznacza czysto\u015b\u0107 HPLC na poziomie 99%, gdy widnieje na \u015bwiadectwie analizy? W wi\u0119kszo\u015bci przypadk\u00f3w oznacza dok\u0142adnie jedno: \u017ce 99% ca\u0142kowitej sca\u0142kowanej powierzchni pik\u00f3w w pojedynczym chromatogramie, zarejestrowanym jednym detektorem przy jednej d\u0142ugo\u015bci fali, przypada\u0142o na jeden pik. Jest to stosunek powierzchni. Sam w sobie nie m\u00f3wi, ile miligram\u00f3w zawarto\u015bci fiolki stanowi zam\u00f3wiony zwi\u0105zek.<\/p>\n<p>Dwie warto\u015bci mog\u0105 si\u0119 r\u00f3\u017cni\u0107 w obu kierunkach i nic na chromatogramie nie m\u00f3wi, w kt\u00f3r\u0105 stron\u0119.<\/p>\n<h2>Co oznacza, a czego nie oznacza 99 procent czysto\u015bci HPLC<\/h2>\n<p>Technika stoj\u0105ca za t\u0105 warto\u015bci\u0105 to <strong>normalizacja powierzchni<\/strong>. Ka\u017cdy pik w analizie jest ca\u0142kowany, powierzchnie s\u0105 sumowane, a ka\u017cdy pik podaje si\u0119 jako procent tej sumy. Nie odwa\u017ca si\u0119 \u017cadnego wzorca zewn\u0119trznego ani nie sporz\u0105dza krzywej kalibracyjnej. Metoda jest szybka, nie wymaga autentycznej pr\u00f3bki zanieczyszczenia i sprawdza si\u0119 w przypadku zwi\u0105zk\u00f3w, kt\u00f3rych nikt nie wyizolowa\u0142.<\/p>\n<p>Opiera si\u0119 r\u00f3wnie\u017c na trzech milcz\u0105cych za\u0142o\u017ceniach:<\/p>\n<ul>\n<li>wszystko, co jest obecne w pr\u00f3bce, opuszcza kolumn\u0119 podczas analizy;<\/li>\n<li>wszystko, co opuszcza kolumn\u0119, daje sygna\u0142 w detektorze;<\/li>\n<li>r\u00f3wne masy r\u00f3\u017cnych zwi\u0105zk\u00f3w daj\u0105 r\u00f3wny sygna\u0142.<\/li>\n<\/ul>\n<p>Wszystkie trzy s\u0105 przybli\u017ceniami. Trzecie z nich zawodzi najcz\u0119\u015bciej, i to bezg\u0142o\u015bnie.<\/p>\n<h2>Dlaczego powierzchnia piku jest sygna\u0142em detektora, a nie ilo\u015bci\u0105 materii<\/h2>\n<p>Detektor UV mierzy absorbancj\u0119 przy wybranej d\u0142ugo\u015bci fali. Absorbancja zale\u017cy od struktury elektronowej cz\u0105steczki przechodz\u0105cej przez kom\u00f3rk\u0119 przep\u0142ywow\u0105. Dwa zwi\u0105zki obecne w identycznych st\u0119\u017ceniach dadz\u0105 identyczne powierzchnie pik\u00f3w tylko wtedy, gdy absorbuj\u0105 identycznie przy tej d\u0142ugo\u015bci fali, co jest raczej zbiegiem okoliczno\u015bci ni\u017c regu\u0142\u0105.<\/p>\n<p>Stosunek tych sygna\u0142\u00f3w ma swoj\u0105 nazw\u0119: <strong>wzgl\u0119dny wsp\u00f3\u0142czynnik odpowiedzi<\/strong> (RRF). Jeden opublikowany przyk\u0142ad czyni t\u0119 skal\u0119 konkretn\u0105. W badaniu zanieczyszcze\u0144 wskazuj\u0105cym na stabilno\u015b\u0107 leku przeciwmalarycznego lumefantryny pochodn\u0105 desbenzyloketow\u0105 (DBK) oznaczono ilo\u015bciowo wzgl\u0119dem lumefantryny przy 266 nm, a jej wzgl\u0119dny wsp\u00f3\u0142czynnik odpowiedzi wyznaczono do\u015bwiadczalnie jako 2,87 &#8211; stosunek powierzchni piku zwi\u0105zku do powierzchni piku lumefantryny przy tym samym st\u0119\u017ceniu. R\u00f3wna masa DBK daje zatem blisko trzykrotnie wi\u0119kszy sygna\u0142. Odczytane jako surowy procent powierzchni, to zanieczyszczenie jest zawy\u017cone mniej wi\u0119cej trzykrotnie.<\/p>\n<p>Organy regulacyjne traktuj\u0105 to jako znany problem o okre\u015blonych granicach. Wytyczna ICH dotycz\u0105ca walidacji procedur analitycznych, Q2(R2), przyj\u0119ta w listopadzie 2023 r., stwierdza, \u017ce gdy analit daje inn\u0105 odpowied\u017a ni\u017c materia\u0142 odniesienia &#8211; na przyk\u0142ad ma inn\u0105 absorbancj\u0119 w\u0142a\u015bciw\u0105 w UV &#8211; wzgl\u0119dne wsp\u00f3\u0142czynniki odpowiedzi nale\u017cy obliczy\u0107 z odpowiedniego stosunku odpowiedzi, oraz \u017ce <em>je\u015bli wzgl\u0119dny wsp\u00f3\u0142czynnik odpowiedzi jest poza zakresem 0,8-1,2, to nale\u017cy zastosowa\u0107 wsp\u00f3\u0142czynnik koryguj\u0105cy<\/em>. Ten sam fragment zawiera wymowny wyj\u0105tek: je\u015bli zanieczyszczenie lub produkt rozk\u0142adu jest przeszacowane, niestosowanie korekty mo\u017ce by\u0107 dopuszczalne. Ta asymetria jest zamierzona. Przeszacowanie zanieczyszczenia jest podej\u015bciem ostro\u017cnym; jego niedoszacowanie \u2013 nie.<\/p>\n<h2>Czego chromatogram nigdy nie poka\u017ce<\/h2>\n<p>Normalizacja powierzchni mo\u017ce jedynie rozdzieli\u0107 to, co zarejestrowa\u0142 detektor. Kilka ca\u0142ych klas materia\u0142u z definicji pozostaje poza tym zbiorem.<\/p>\n<ul>\n<li><strong>Zwi\u0105zki bez chromoforu.<\/strong> Je\u015bli substancja czynna lub niekt\u00f3re z jej zanieczyszcze\u0144 nie posiadaj\u0105 chromoforu poch\u0142aniaj\u0105cego promieniowanie UV, nie b\u0119d\u0105 wykryte w rutynowej analizie HPLC przy u\u017cyciu samego detektora UV i nale\u017cy zastosowa\u0107 alternatywny schemat detekcji.<\/li>\n<li><strong>Pozosta\u0142o\u015bci rozpuszczalnik\u00f3w.<\/strong> ICH Q3C(R9) wyra\u017anie stwierdza, \u017ce pozosta\u0142o\u015bci rozpuszczalnik\u00f3w s\u0105 zazwyczaj oznaczane za pomoc\u0105 technik chromatograficznych, takich jak chromatografia gazowa. S\u0105 one oddzielnym testem, zwykle przeprowadzanym metod\u0105 GC z fazy nadpowierzchniowej, a nie pikiem w chromatogramie cieczowym.<\/li>\n<li><strong>Woda.<\/strong> Miareczkowanie Karla Fischera jest standardow\u0105 metod\u0105 oznaczania zawarto\u015bci wody w substancjach organicznych. Woda jest na og\u00f3\u0142 niewidoczna dla detektora UV i nie jest uwzgl\u0119dniana w wyniku procentu powierzchni.<\/li>\n<li><strong>Zanieczyszczenia pierwiastkowe.<\/strong> ICH Q3D(R2) wymaga, aby \u2013 o ile nie uzasadniono inaczej \u2013 badanie by\u0142o specyficzne dla ka\u017cdego zanieczyszczenia pierwiastkowego wskazanego do kontroli, z u\u017cyciem procedur farmakopealnych lub odpowiednich procedur alternatywnych. Pozosta\u0142o\u015bci katalizator\u00f3w i metale mierzy si\u0119 technikami takimi jak ICP-MS, nigdy przez ca\u0142kowanie pik\u00f3w.<\/li>\n<li><strong>Materia\u0142, kt\u00f3ry nigdy nie eluuje.<\/strong> Materia\u0142 silnie zatrzymywany lub nierozpuszczalny nie wnosi w og\u00f3le \u017cadnej powierzchni i dlatego nie mo\u017ce pojawi\u0107 si\u0119 w mianowniku.<\/li>\n<\/ul>\n<p>Wynik 99,5% powierzchni jest zatem stwierdzeniem dotycz\u0105cym frakcji pr\u00f3bki aktywnej w UV i eluowanej z kolumny. Wszystko inne trzeba ustali\u0107 innym pomiarem \u2013 albo nie ustala si\u0119 tego wcale.<\/p>\n<h2>Jak ICH Q3A okre\u015bla liczb\u0119, kt\u00f3r\u0105 czytasz<\/h2>\n<p class=\"translation-block\">S\u0142ownictwo u\u017cywane na wi\u0119kszo\u015bci \u015bwiadectw analizy pochodzi z ICH Q3A(R2), <em>Impurities in New Drug Substances<\/em>, kt\u00f3rej obecna wersja Step 4 nosi dat\u0119 25 pa\u017adziernika 2006 r. Okre\u015bla ona trzy progi powi\u0105zane z maksymaln\u0105 dawk\u0105 dobow\u0105 produktu leczniczego: <strong>pr\u00f3g raportowania<\/strong>, powy\u017cej kt\u00f3rego zanieczyszczenie nale\u017cy raportowa\u0107, <strong>pr\u00f3g identyfikacji<\/strong>, powy\u017cej kt\u00f3rego nale\u017cy je zidentyfikowa\u0107 strukturalnie, oraz <strong>pr\u00f3g kwalifikacji<\/strong>, powy\u017cej kt\u00f3rego nale\u017cy ustali\u0107 jego bezpiecze\u0144stwo biologiczne. Dla maksymalnej dawki dobowej wynosz\u0105cej 2 g\/dzie\u0144 lub mniej wytyczna ustala je na poziomie 0,05%, 0,10% (lub 1,0 mg przyjmowanego dziennie, w zale\u017cno\u015bci od tego, kt\u00f3ra warto\u015b\u0107 jest ni\u017csza) i 0,15% (lub 1,0 mg przyjmowanego dziennie, w zale\u017cno\u015bci od tego, kt\u00f3ra warto\u015b\u0107 jest ni\u017csza). Powy\u017cej 2 g\/dzie\u0144 progi zaostrzaj\u0105 si\u0119 do 0,03%, 0,05% i 0,05%.<\/p>\n<p>Dwa szczeg\u00f3\u0142y w Q3A warto przeczyta\u0107 uwa\u017cnie. Po pierwsze, wytyczna dopuszcza u\u017cycie samej substancji leczniczej jako wzorca do oszacowania poziom\u00f3w zanieczyszcze\u0144 i uznaje, \u017ce gdy wsp\u00f3\u0142czynniki odpowiedzi nie s\u0105 zbli\u017cone, pozostaje to w\u0142a\u015bciwe, o ile zastosuje si\u0119 wsp\u00f3\u0142czynnik koryguj\u0105cy albo zanieczyszczenia s\u0105 faktycznie przeszacowane. Po drugie, stwierdza ona, \u017ce kryteria akceptacji i procedury szacowania zanieczyszcze\u0144 <em>mog\u0105 opiera\u0107 si\u0119 na za\u0142o\u017ceniach analitycznych (np. r\u00f3wnowa\u017cna odpowied\u017a detektora)<\/em>, a za\u0142o\u017cenia te nale\u017cy om\u00f3wi\u0107 we wniosku. Wytyczna nie udaje, \u017ce procent powierzchni r\u00f3wna si\u0119 procentowi masowemu. Wymaga wyra\u017anego stwierdzenia, \u017ce takie za\u0142o\u017cenie si\u0119 przyjmuje.<\/p>\n<p>Progi te dotycz\u0105 produkt\u00f3w leczniczych i s\u0105 powi\u0105zane z dawk\u0105 dobow\u0105, wi\u0119c nie przenosz\u0105 si\u0119 bezpo\u015brednio na odczynnik katalogowy. Pozostaj\u0105 jednak najbardziej u\u017cytecznym wsp\u00f3lnym s\u0142ownikiem do omawiania tego, co deklaruje \u015bwiadectwo analizy.<\/p>\n<h2>Normalizacja powierzchni a bilans masy: dwa r\u00f3\u017cne pytania<\/h2>\n<p>Gdy warto\u015b\u0107 czysto\u015bci ma mie\u0107 znaczenie metrologiczne, zamiast normalizacji powierzchni stosuje si\u0119 <strong>bilans masy<\/strong> &#8211; ka\u017cd\u0105 klas\u0119 zanieczyszcze\u0144 mierzy si\u0119 odpowiedni\u0105 dla niej technik\u0105, a sum\u0119 odejmuje si\u0119 od 100 procent. Badanie z 2024 roku dotycz\u0105ce wyznaczania czysto\u015bci tripropylofosforanu opisuje t\u0119 metod\u0119 jako po\u015bredni\u0105, polegaj\u0105c\u0105 na osobnym pomiarze zawarto\u015bci r\u00f3\u017cnych typ\u00f3w zanieczyszcze\u0144 i odj\u0119ciu ich od 100 procent; obejmuje ona strukturalnie pokrewne zanieczyszczenia organiczne, wod\u0119, pozosta\u0142o\u015bci rozpuszczalnik\u00f3w organicznych oraz zanieczyszczenia nieorganiczne &#8211; w tej pracy oznaczane odpowiednio chromatografi\u0105, miareczkowaniem Karla Fischera, headspace GC z detektorem p\u0142omieniowo-jonizacyjnym oraz ICP-MS.<\/p>\n<p>Bilans masy ma w\u0142asn\u0105 s\u0142abo\u015b\u0107: pozwala odj\u0105\u0107 wy\u0142\u0105cznie te zanieczyszczenia, kt\u00f3rych kto\u015b postanowi\u0142 szuka\u0107. To samo badanie \u0142\u0105czy go z ilo\u015bciowym NMR, poniewa\u017c qNMR odpowiada na ograniczenie polegaj\u0105ce na tym, \u017ce bilans masy mo\u017ce nie wykry\u0107 wszystkich zanieczyszcze\u0144.<\/p>\n<table>\n<tr>\n<th>Podej\u015bcie<\/th>\n<th>Pytanie, na kt\u00f3re odpowiada<\/th>\n<th>Kluczowe za\u0142o\u017cenie<\/th>\n<th>Typowe techniki<\/th>\n<\/tr>\n<tr>\n<td>Normalizacja powierzchni<\/td>\n<td>Jaka cz\u0119\u015b\u0107 wykrytego sygna\u0142u to g\u0142\u00f3wny pik?<\/td>\n<td>Jednakowa odpowied\u017a detektora na jednostk\u0119 masy<\/td>\n<td>HPLC-UV, HPLC-DAD, GC-FID<\/td>\n<\/tr>\n<tr>\n<td>Oznaczanie wobec wzorca<\/td>\n<td>Ile analitu znajduje si\u0119 w pr\u00f3bce w por\u00f3wnaniu do wzorca?<\/td>\n<td>Czysto\u015b\u0107 wzorca analitycznego jest znana<\/td>\n<td>HPLC z wzorcem zewn\u0119trznym lub wewn\u0119trznym<\/td>\n<\/tr>\n<tr>\n<td>Bilans masy<\/td>\n<td>Czym jest wszystko, co nie jest analitem?<\/td>\n<td>Poszukiwano wszystkich klas zanieczyszcze\u0144<\/td>\n<td>HPLC, metoda Karla Fischera, headspace GC-FID, ICP-MS<\/td>\n<\/tr>\n<tr>\n<td>NMR ilo\u015bciowy<\/td>\n<td>Jaki jest u\u0142amek masowy analitu, mierzony bezpo\u015brednio?<\/td>\n<td>Czyste, ca\u0142kowalne i przypisywalne sygna\u0142y<\/td>\n<td>qNMR 1H lub 31P wzgl\u0119dem certyfikowanego wzorca analitycznego<\/td>\n<\/tr>\n<\/table>\n<h2>Odczytywanie \u015bwiadectwa analizy bez nadinterpretacji<\/h2>\n<p>Pi\u0119\u0107 pyta\u0144 oddziela warto\u015b\u0107 czysto\u015bci, kt\u00f3rej mo\u017cesz u\u017cy\u0107, od takiej, kt\u00f3r\u0105 mo\u017cesz tylko zacytowa\u0107.<\/p>\n<ol>\n<li><strong>Metoda i detektor.<\/strong> HPLC-UV, HPLC-CAD, GC-FID i qNMR odpowiadaj\u0105 na r\u00f3\u017cne pytania i nie s\u0105 wymienne.<\/li>\n<li><strong>D\u0142ugo\u015b\u0107 fali.<\/strong> Procent zapisany przy 254 nm i procent zapisany przy 210 nm mog\u0105 opisywa\u0107 t\u0119 sam\u0105 fiolk\u0119 i si\u0119 r\u00f3\u017cni\u0107.<\/li>\n<li><strong>Procent powierzchni lub oznaczanie zawarto\u015bci.<\/strong> Procent powierzchni nie ma zewn\u0119trznego odniesienia; wynik oznaczenia zawarto\u015bci je ma. Tylko jeden z nich zapewnia sp\u00f3jno\u015b\u0107 pomiarow\u0105 z mas\u0105.<\/li>\n<li><strong>Wsp\u00f3\u0142czynniki odpowiedzi.<\/strong> Czy wyznaczono RRF i czy zastosowano wsp\u00f3\u0142czynniki koryguj\u0105ce tam, gdzie warto\u015bci wykracza\u0142y poza zakres 0,8-1,2?<\/li>\n<li><strong>Odr\u0119bne badania.<\/strong> Woda, pozosta\u0142o\u015bci rozpuszczalnik\u00f3w i zanieczyszczenia pierwiastkowe wymagaj\u0105 osobnych pozycji w dokumencie.<\/li>\n<\/ol>\n<p>Dwie partie mog\u0105 obie wykazywa\u0107 99,5% i r\u00f3\u017cni\u0107 si\u0119 tym, co zawiera pozosta\u0142e 0,5%, jak du\u017co tego faktycznie jest oraz jak wiele nigdy nie znalaz\u0142o si\u0119 na chromatogramie. Dla materia\u0142u u\u017cywanego jako <a href=\"https:\/\/nonsensia.pl\/pl\/rules\/\">wzorzec analityczny w pracy laboratoryjnej<\/a>, ta r\u00f3\u017cnica jest ca\u0142ym sednem dokumentacji.<\/p>\n<h2>Cz\u0119sto zadawane pytania<\/h2>\n<h3>Co w\u0142a\u015bciwie oznacza 99% czysto\u015bci wed\u0142ug HPLC?<\/h3>\n<p>Zwykle oznacza to, \u017ce 99 procent ca\u0142kowitej sca\u0142kowanej powierzchni pik\u00f3w w jednym chromatogramie przypada\u0142o na pik g\u0142\u00f3wny. Jest to stosunek sygna\u0142\u00f3w detektora, a nie mas. Dotyczy tylko substancji, kt\u00f3re zosta\u0142y wymyte z kolumny i da\u0142y odpowied\u017a w u\u017cytym detektorze, przy u\u017cytej d\u0142ugo\u015bci fali.<\/p>\n<h3>Czy procent powierzchni w HPLC jest tym samym co wynik oznaczenia zawarto\u015bci?<\/h3>\n<p>Nie. Procent powierzchni jest wielko\u015bci\u0105 wewn\u0119trzn\u0105 pojedynczego chromatogramu i nie korzysta z zewn\u0119trznego odniesienia. Oznaczenie zawarto\u015bci por\u00f3wnuje odpowied\u017a analitu z odwa\u017conym materia\u0142em odniesienia o znanej zawarto\u015bci, co zapewnia sp\u00f3jno\u015b\u0107 pomiarow\u0105 z mas\u0105. Te dwie warto\u015bci cz\u0119sto r\u00f3\u017cni\u0105 si\u0119 dla tej samej pr\u00f3bki i odpowiadaj\u0105 na r\u00f3\u017cne pytania.<\/p>\n<h3>Czy wynik czysto\u015bci HPLC uwzgl\u0119dnia wod\u0119 i pozosta\u0142o\u015bci rozpuszczalnik\u00f3w?<\/h3>\n<p>Na og\u00f3\u0142 nie. Wod\u0119 oznacza si\u0119 metod\u0105 miareczkowania Karla Fischera, a ICH Q3C(R9) zaznacza, \u017ce pozosta\u0142o\u015bci rozpuszczalnik\u00f3w oznacza si\u0119 zwykle technikami chromatograficznymi, takimi jak chromatografia gazowa. \u017badne z nich nie pojawia si\u0119 jako sca\u0142kowany pik w rutynowej analizie HPLC-UV w uk\u0142adzie faz odwr\u00f3conych, wi\u0119c \u017cadne nie jest odejmowane w wyniku procentu powierzchni.<\/p>\n<h3>Co to jest pr\u00f3g raportowania w ICH Q3A?<\/h3>\n<p>ICH Q3A(R2) okre\u015bla pr\u00f3g raportowania jako limit, powy\u017cej kt\u00f3rego zanieczyszczenie powinno by\u0107 zg\u0142oszone. Dla maksymalnej dziennej dawki wynosz\u0105cej 2 g\/dzie\u0144 lub mniej ustalono go na poziomie 0,05%; powy\u017cej 2 g\/dzie\u0144 pr\u00f3g ten zaostrza si\u0119 do 0,03%. Wytyczna wymaga r\u00f3wnie\u017c, aby granica oznaczalno\u015bci procedury nie by\u0142a wy\u017csza ni\u017c ten pr\u00f3g.<\/p>\n<h3>Dlaczego dwie partie o tym samym stopniu czysto\u015bci mog\u0105 mie\u0107 r\u00f3\u017cne profile zanieczyszcze\u0144?<\/h3>\n<p>Poniewa\u017c procent powierzchni opisuje sum\u0119, a nie sk\u0142ad. R\u00f3\u017cne syntezy, rozpuszczalniki i historie przechowywania daj\u0105 r\u00f3\u017cne substancje pokrewne, a ka\u017cda z nich ma w\u0142asn\u0105 odpowied\u017a detektora. Ta sama warto\u015b\u0107 podawana na pierwszym planie mo\u017ce zatem odpowiada\u0107 r\u00f3\u017cnym substancjom obecnym w r\u00f3\u017cnych rzeczywistych ilo\u015bciach.<\/p>\n<h3>Czy HPLC mo\u017ce wykry\u0107 ka\u017cde zanieczyszczenie w pr\u00f3bce?<\/h3>\n<p>Nie. Zwi\u0105zki pozbawione chromoforu absorbuj\u0105cego UV nie s\u0105 widoczne dla detektora UV, zanieczyszczenia nieorganiczne i pierwiastkowe wymagaj\u0105 procedur specyficznych dla pierwiastk\u00f3w zgodnie z ICH Q3D(R2), lotne rozpuszczalniki s\u0105 oznaczane metod\u0105 chromatografii gazowej, a wszystko, co nie eluuje, nie wnosi \u017cadnego piku. Pe\u0142na charakterystyka wymaga kilku metod ortogonalnych.<\/p>\n<h2>Bibliografia<\/h2>\n<ol>\n<li><a href=\"https:\/\/database.ich.org\/sites\/default\/files\/Q3A(R2)%20Guideline.pdf\" rel=\"nofollow noopener\" target=\"_blank\">ICH, Impurities in New Drug Substances Q3A(R2), Step 4 version dated 25 October 2006<\/a><\/li>\n<li><a href=\"https:\/\/database.ich.org\/sites\/default\/files\/ICH_Q2(R2)_Guideline_2023_1130.pdf\" rel=\"nofollow noopener\" target=\"_blank\">ICH, Validation of Analytical Procedures Q2(R2), final version adopted 1 November 2023<\/a><\/li>\n<li><a href=\"https:\/\/database.ich.org\/sites\/default\/files\/ICH_Q3C(R9)_Guideline_MinorRevision_2024_2024_Approved.pdf\" rel=\"nofollow noopener\" target=\"_blank\">ICH, Impurities: Guideline for Residual Solvents Q3C(R9), Step 4 version dated 24 January 2024<\/a><\/li>\n<li><a href=\"https:\/\/database.ich.org\/sites\/default\/files\/Q3D-R2_Guideline_Step4_2022_0308.pdf\" rel=\"nofollow noopener\" target=\"_blank\">ICH, Guideline for Elemental Impurities Q3D(R2), adopted 26 April 2022<\/a><\/li>\n<li><a href=\"https:\/\/doi.org\/10.1186\/1475-2875-10-51\" rel=\"nofollow noopener\" target=\"_blank\">Verbeken M. et al., Stability-indicating HPLC-DAD\/UV-ESI\/MS impurity profiling of the anti-malarial drug lumefantrine, Malaria Journal, 2011<\/a><\/li>\n<li><a href=\"https:\/\/doi.org\/10.3390\/molecules29091975\" rel=\"nofollow noopener\" target=\"_blank\">Wan Y. et al., Purity Assessment of Tripropyl Phosphate through Mass Balance and 1H and 31P Quantitative Nuclear Magnetic Resonance, Molecules, 2024<\/a><\/li>\n<li><a href=\"https:\/\/doi.org\/10.1016\/j.chroma.2007.10.111\" rel=\"nofollow noopener\" target=\"_blank\">Vervoort N., Daemen D., Torok G., Performance evaluation of evaporative light scattering detection and charged aerosol detection in reversed phase liquid chromatography, Journal of Chromatography A, 2008<\/a><\/li>\n<\/ol>\n<hr \/>\n<p class=\"ns-disclaimer\"><strong>Tylko do cel\u00f3w badawczych.<\/strong> Nonsensia dostarcza wzorce analityczne do zastosowa\u0144 laboratoryjnych i badawczych. Niniejszy artyku\u0142 jest publikowany w celach naukowych i edukacyjnych. Nie stanowi on porady medycznej, nie opisuje \u017cadnego zastosowania u ludzi, a nic w nim zawartego nie powinno by\u0107 odczytywane jako zalecenie podania jakiejkolwiek substancji osobie lub zwierz\u0119ciu.<\/p>","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Warto\u015b\u0107 czysto\u015bci HPLC jest stosunkiem powierzchni pik\u00f3w, a nie stosunkiem mas, i oba te parametry mog\u0105 si\u0119 r\u00f3\u017cni\u0107 w obu kierunkach. Oto co zak\u0142ada ta liczba, co pomija milczeniem i co nale\u017cy sprawdzi\u0107 na \u015bwiadectwie analizy, zanim mo\u017cna jej zaufa\u0107.<\/p>","protected":false},"author":517,"featured_media":11780,"comment_status":"closed","ping_status":"closed","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"footnotes":""},"categories":[385],"tags":[],"class_list":["post-11738","post","type-post","status-publish","format-standard","has-post-thumbnail","hentry","category-analytical-methods"],"yoast_head":"<!-- This site is optimized with the Yoast SEO plugin v27.9 - https:\/\/yoast.com\/product\/yoast-seo-wordpress\/ -->\n<title>What Does 99 Percent HPLC Purity Actually Mean?<\/title>\n<meta name=\"description\" content=\"Area normalisation, detector response factors and the impurities a chromatogram never shows. How to read an HPLC purity figure without over-reading it.\" \/>\n<meta name=\"robots\" content=\"noindex, follow\" \/>\n<meta property=\"og:locale\" content=\"pl_PL\" \/>\n<meta property=\"og:type\" content=\"article\" \/>\n<meta property=\"og:title\" content=\"What Does 99 Percent HPLC Purity Actually Mean?\" \/>\n<meta property=\"og:description\" content=\"Area normalisation, detector response factors and the impurities a chromatogram never shows. How to read an HPLC purity figure without over-reading it.\" \/>\n<meta property=\"og:url\" content=\"https:\/\/nonsensia.pl\/pl\/2026\/10\/30\/hplc-purity-number-area-normalisation\/\" \/>\n<meta property=\"og:site_name\" content=\"Nonsensia\" \/>\n<meta property=\"article:published_time\" content=\"2026-10-30T10:38:25+00:00\" \/>\n<meta property=\"og:image\" content=\"https:\/\/nonsensia.pl\/wp-content\/uploads\/2026\/09\/nonsensia-analytical-methods.png\" \/>\n\t<meta property=\"og:image:width\" content=\"1200\" \/>\n\t<meta property=\"og:image:height\" content=\"630\" \/>\n\t<meta property=\"og:image:type\" content=\"image\/png\" \/>\n<meta name=\"author\" content=\"Thomas Reyner\" \/>\n<meta name=\"twitter:card\" content=\"summary_large_image\" \/>\n<meta name=\"twitter:label1\" content=\"Napisane przez\" \/>\n\t<meta name=\"twitter:data1\" content=\"Thomas Reyner\" \/>\n\t<meta name=\"twitter:label2\" content=\"Szacowany czas czytania\" \/>\n\t<meta name=\"twitter:data2\" content=\"10 minut\" \/>\n<script type=\"application\/ld+json\" class=\"yoast-schema-graph\">{\"@context\":\"https:\\\/\\\/schema.org\",\"@graph\":[{\"@type\":\"Article\",\"@id\":\"https:\\\/\\\/nonsensia.pl\\\/2026\\\/10\\\/30\\\/hplc-purity-number-area-normalisation\\\/#article\",\"isPartOf\":{\"@id\":\"https:\\\/\\\/nonsensia.pl\\\/2026\\\/10\\\/30\\\/hplc-purity-number-area-normalisation\\\/\"},\"author\":{\"name\":\"Thomas Reyner\",\"@id\":\"https:\\\/\\\/nonsensia.pl\\\/#\\\/schema\\\/person\\\/97c0a8a75ea8c654fd606679bb6d01fb\"},\"headline\":\"What an HPLC Purity Number Actually Measures\",\"datePublished\":\"2026-10-30T10:38:25+00:00\",\"mainEntityOfPage\":{\"@id\":\"https:\\\/\\\/nonsensia.pl\\\/2026\\\/10\\\/30\\\/hplc-purity-number-area-normalisation\\\/\"},\"wordCount\":1924,\"publisher\":{\"@id\":\"https:\\\/\\\/nonsensia.pl\\\/#organization\"},\"image\":{\"@id\":\"https:\\\/\\\/nonsensia.pl\\\/2026\\\/10\\\/30\\\/hplc-purity-number-area-normalisation\\\/#primaryimage\"},\"thumbnailUrl\":\"https:\\\/\\\/nonsensia.pl\\\/wp-content\\\/uploads\\\/2026\\\/09\\\/nonsensia-analytical-methods.png\",\"articleSection\":[\"Analytical Methods\"],\"inLanguage\":\"pl-PL\",\"copyrightYear\":\"2026\",\"copyrightHolder\":{\"@id\":\"https:\\\/\\\/nonsensia.pl\\\/pl\\\/#organization\"}},{\"@type\":\"WebPage\",\"@id\":\"https:\\\/\\\/nonsensia.pl\\\/2026\\\/10\\\/30\\\/hplc-purity-number-area-normalisation\\\/\",\"url\":\"https:\\\/\\\/nonsensia.pl\\\/2026\\\/10\\\/30\\\/hplc-purity-number-area-normalisation\\\/\",\"name\":\"What Does 99 Percent HPLC Purity Actually Mean?\",\"isPartOf\":{\"@id\":\"https:\\\/\\\/nonsensia.pl\\\/#website\"},\"primaryImageOfPage\":{\"@id\":\"https:\\\/\\\/nonsensia.pl\\\/2026\\\/10\\\/30\\\/hplc-purity-number-area-normalisation\\\/#primaryimage\"},\"image\":{\"@id\":\"https:\\\/\\\/nonsensia.pl\\\/2026\\\/10\\\/30\\\/hplc-purity-number-area-normalisation\\\/#primaryimage\"},\"thumbnailUrl\":\"https:\\\/\\\/nonsensia.pl\\\/wp-content\\\/uploads\\\/2026\\\/09\\\/nonsensia-analytical-methods.png\",\"datePublished\":\"2026-10-30T10:38:25+00:00\",\"description\":\"Area normalisation, detector response factors and the impurities a chromatogram never shows. How to read an HPLC purity figure without over-reading it.\",\"breadcrumb\":{\"@id\":\"https:\\\/\\\/nonsensia.pl\\\/2026\\\/10\\\/30\\\/hplc-purity-number-area-normalisation\\\/#breadcrumb\"},\"inLanguage\":\"pl-PL\",\"potentialAction\":[{\"@type\":\"ReadAction\",\"target\":[\"https:\\\/\\\/nonsensia.pl\\\/2026\\\/10\\\/30\\\/hplc-purity-number-area-normalisation\\\/\"]}]},{\"@type\":\"ImageObject\",\"inLanguage\":\"pl-PL\",\"@id\":\"https:\\\/\\\/nonsensia.pl\\\/2026\\\/10\\\/30\\\/hplc-purity-number-area-normalisation\\\/#primaryimage\",\"url\":\"https:\\\/\\\/nonsensia.pl\\\/wp-content\\\/uploads\\\/2026\\\/09\\\/nonsensia-analytical-methods.png\",\"contentUrl\":\"https:\\\/\\\/nonsensia.pl\\\/wp-content\\\/uploads\\\/2026\\\/09\\\/nonsensia-analytical-methods.png\",\"width\":1200,\"height\":630,\"caption\":\"Analytical Methods \u2014 analytical reference standards, Nonsensia\"},{\"@type\":\"BreadcrumbList\",\"@id\":\"https:\\\/\\\/nonsensia.pl\\\/2026\\\/10\\\/30\\\/hplc-purity-number-area-normalisation\\\/#breadcrumb\",\"itemListElement\":[{\"@type\":\"ListItem\",\"position\":1,\"name\":\"Home\",\"item\":\"https:\\\/\\\/nonsensia.pl\\\/\"},{\"@type\":\"ListItem\",\"position\":2,\"name\":\"What an HPLC Purity Number Actually Measures\"}]},{\"@type\":\"WebSite\",\"@id\":\"https:\\\/\\\/nonsensia.pl\\\/#website\",\"url\":\"https:\\\/\\\/nonsensia.pl\\\/\",\"name\":\"Nonsensia\",\"description\":\"NON-SENSIA...? We bring sense!\",\"publisher\":{\"@id\":\"https:\\\/\\\/nonsensia.pl\\\/#organization\"},\"potentialAction\":[{\"@type\":\"SearchAction\",\"target\":{\"@type\":\"EntryPoint\",\"urlTemplate\":\"https:\\\/\\\/nonsensia.pl\\\/?s={search_term_string}\"},\"query-input\":{\"@type\":\"PropertyValueSpecification\",\"valueRequired\":true,\"valueName\":\"search_term_string\"}}],\"inLanguage\":\"pl-PL\"},{\"@type\":[\"Organization\",\"Place\"],\"@id\":\"https:\\\/\\\/nonsensia.pl\\\/#organization\",\"name\":\"Nonsensia\",\"url\":\"https:\\\/\\\/nonsensia.pl\\\/\",\"logo\":{\"@id\":\"https:\\\/\\\/nonsensia.pl\\\/2026\\\/10\\\/30\\\/hplc-purity-number-area-normalisation\\\/#local-main-organization-logo\"},\"image\":{\"@id\":\"https:\\\/\\\/nonsensia.pl\\\/2026\\\/10\\\/30\\\/hplc-purity-number-area-normalisation\\\/#local-main-organization-logo\"},\"telephone\":[],\"openingHoursSpecification\":[{\"@type\":\"OpeningHoursSpecification\",\"dayOfWeek\":[\"Monday\",\"Tuesday\",\"Wednesday\",\"Thursday\",\"Friday\",\"Saturday\",\"Sunday\"],\"opens\":\"09:00\",\"closes\":\"17:00\"}],\"address\":{\"@type\":\"PostalAddress\",\"streetAddress\":\"ul. Marsza\u0142kowska 80\",\"postalCode\":\"00-517\",\"addressLocality\":\"Warszawa\",\"addressCountry\":\"PL\"},\"email\":\"lab@nonsensia.pl\"},{\"@type\":\"Person\",\"@id\":\"https:\\\/\\\/nonsensia.pl\\\/#\\\/schema\\\/person\\\/97c0a8a75ea8c654fd606679bb6d01fb\",\"name\":\"Thomas Reyner\",\"image\":{\"@type\":\"ImageObject\",\"inLanguage\":\"pl-PL\",\"@id\":\"https:\\\/\\\/secure.gravatar.com\\\/avatar\\\/17721409ed81a1e4666b08b23530653af17971df2e2cde4fad397c4da1e60ba7?s=96&d=mm&r=g\",\"url\":\"https:\\\/\\\/secure.gravatar.com\\\/avatar\\\/17721409ed81a1e4666b08b23530653af17971df2e2cde4fad397c4da1e60ba7?s=96&d=mm&r=g\",\"contentUrl\":\"https:\\\/\\\/secure.gravatar.com\\\/avatar\\\/17721409ed81a1e4666b08b23530653af17971df2e2cde4fad397c4da1e60ba7?s=96&d=mm&r=g\",\"caption\":\"Thomas Reyner\"},\"description\":\"Writes on spectroscopy, structural elucidation and laboratory instrumentation for Nonsensia.\",\"url\":\"https:\\\/\\\/nonsensia.pl\\\/pl\\\/author\\\/treyner\\\/\"},{\"@type\":\"ImageObject\",\"inLanguage\":\"pl-PL\",\"@id\":\"https:\\\/\\\/nonsensia.pl\\\/2026\\\/10\\\/30\\\/hplc-purity-number-area-normalisation\\\/#local-main-organization-logo\",\"url\":\"https:\\\/\\\/nonsensia.pl\\\/wp-content\\\/uploads\\\/2024\\\/12\\\/cropped-Nonsensia_Logo-8.png\",\"contentUrl\":\"https:\\\/\\\/nonsensia.pl\\\/wp-content\\\/uploads\\\/2024\\\/12\\\/cropped-Nonsensia_Logo-8.png\",\"width\":512,\"height\":512,\"caption\":\"Nonsensia\"}]}<\/script>\n<!-- \/ Yoast SEO plugin. -->","yoast_head_json":{"title":"Co tak naprawd\u0119 oznacza 99% czysto\u015bci wed\u0142ug HPLC?","description":"Normalizacja powierzchni, wsp\u00f3\u0142czynniki odpowiedzi detektora i zanieczyszczenia niewidoczne na chromatogramie. Jak czyta\u0107 wynik HPLC bez nadinterpretacji.","robots":{"index":"noindex","follow":"follow"},"og_locale":"pl_PL","og_type":"article","og_title":"What Does 99 Percent HPLC Purity Actually Mean?","og_description":"Area normalisation, detector response factors and the impurities a chromatogram never shows. How to read an HPLC purity figure without over-reading it.","og_url":"https:\/\/nonsensia.pl\/pl\/2026\/10\/30\/hplc-purity-number-area-normalisation\/","og_site_name":"Nonsensia","article_published_time":"2026-10-30T10:38:25+00:00","og_image":[{"width":1200,"height":630,"url":"https:\/\/nonsensia.pl\/wp-content\/uploads\/2026\/09\/nonsensia-analytical-methods.png","type":"image\/png"}],"author":"Thomas Reyner","twitter_card":"summary_large_image","twitter_misc":{"Napisane przez":"Thomas Reyner","Szacowany czas czytania":"10 minut"},"schema":{"@context":"https:\/\/schema.org","@graph":[{"@type":"Article","@id":"https:\/\/nonsensia.pl\/2026\/10\/30\/hplc-purity-number-area-normalisation\/#article","isPartOf":{"@id":"https:\/\/nonsensia.pl\/2026\/10\/30\/hplc-purity-number-area-normalisation\/"},"author":{"name":"Thomas Reyner","@id":"https:\/\/nonsensia.pl\/#\/schema\/person\/97c0a8a75ea8c654fd606679bb6d01fb"},"headline":"What an HPLC Purity Number Actually Measures","datePublished":"2026-10-30T10:38:25+00:00","mainEntityOfPage":{"@id":"https:\/\/nonsensia.pl\/2026\/10\/30\/hplc-purity-number-area-normalisation\/"},"wordCount":1924,"publisher":{"@id":"https:\/\/nonsensia.pl\/#organization"},"image":{"@id":"https:\/\/nonsensia.pl\/2026\/10\/30\/hplc-purity-number-area-normalisation\/#primaryimage"},"thumbnailUrl":"https:\/\/nonsensia.pl\/wp-content\/uploads\/2026\/09\/nonsensia-analytical-methods.png","articleSection":["Analytical Methods"],"inLanguage":"pl-PL","copyrightYear":"2026","copyrightHolder":{"@id":"https:\/\/nonsensia.pl\/pl\/#organization"}},{"@type":"WebPage","@id":"https:\/\/nonsensia.pl\/2026\/10\/30\/hplc-purity-number-area-normalisation\/","url":"https:\/\/nonsensia.pl\/2026\/10\/30\/hplc-purity-number-area-normalisation\/","name":"Co tak naprawd\u0119 oznacza 99% czysto\u015bci wed\u0142ug HPLC?","isPartOf":{"@id":"https:\/\/nonsensia.pl\/#website"},"primaryImageOfPage":{"@id":"https:\/\/nonsensia.pl\/2026\/10\/30\/hplc-purity-number-area-normalisation\/#primaryimage"},"image":{"@id":"https:\/\/nonsensia.pl\/2026\/10\/30\/hplc-purity-number-area-normalisation\/#primaryimage"},"thumbnailUrl":"https:\/\/nonsensia.pl\/wp-content\/uploads\/2026\/09\/nonsensia-analytical-methods.png","datePublished":"2026-10-30T10:38:25+00:00","description":"Normalizacja powierzchni, wsp\u00f3\u0142czynniki odpowiedzi detektora i zanieczyszczenia niewidoczne na chromatogramie. Jak czyta\u0107 wynik HPLC bez nadinterpretacji.","breadcrumb":{"@id":"https:\/\/nonsensia.pl\/2026\/10\/30\/hplc-purity-number-area-normalisation\/#breadcrumb"},"inLanguage":"pl-PL","potentialAction":[{"@type":"ReadAction","target":["https:\/\/nonsensia.pl\/2026\/10\/30\/hplc-purity-number-area-normalisation\/"]}]},{"@type":"ImageObject","inLanguage":"pl-PL","@id":"https:\/\/nonsensia.pl\/2026\/10\/30\/hplc-purity-number-area-normalisation\/#primaryimage","url":"https:\/\/nonsensia.pl\/wp-content\/uploads\/2026\/09\/nonsensia-analytical-methods.png","contentUrl":"https:\/\/nonsensia.pl\/wp-content\/uploads\/2026\/09\/nonsensia-analytical-methods.png","width":1200,"height":630,"caption":"Analytical Methods \u2014 analytical reference standards, Nonsensia"},{"@type":"BreadcrumbList","@id":"https:\/\/nonsensia.pl\/2026\/10\/30\/hplc-purity-number-area-normalisation\/#breadcrumb","itemListElement":[{"@type":"ListItem","position":1,"name":"Home","item":"https:\/\/nonsensia.pl\/"},{"@type":"ListItem","position":2,"name":"What an HPLC Purity Number Actually Measures"}]},{"@type":"WebSite","@id":"https:\/\/nonsensia.pl\/#website","url":"https:\/\/nonsensia.pl\/","name":"Nonsensia","description":"NON-SENSIA...? Wnosimy sens!","publisher":{"@id":"https:\/\/nonsensia.pl\/#organization"},"potentialAction":[{"@type":"SearchAction","target":{"@type":"EntryPoint","urlTemplate":"https:\/\/nonsensia.pl\/?s={search_term_string}"},"query-input":{"@type":"PropertyValueSpecification","valueRequired":true,"valueName":"search_term_string"}}],"inLanguage":"pl-PL"},{"@type":["Organization","Place"],"@id":"https:\/\/nonsensia.pl\/#organization","name":"Nonsensia","url":"https:\/\/nonsensia.pl\/","logo":{"@id":"https:\/\/nonsensia.pl\/2026\/10\/30\/hplc-purity-number-area-normalisation\/#local-main-organization-logo"},"image":{"@id":"https:\/\/nonsensia.pl\/2026\/10\/30\/hplc-purity-number-area-normalisation\/#local-main-organization-logo"},"telephone":[],"openingHoursSpecification":[{"@type":"OpeningHoursSpecification","dayOfWeek":["Monday","Tuesday","Wednesday","Thursday","Friday","Saturday","Sunday"],"opens":"09:00","closes":"17:00"}],"address":{"@type":"PostalAddress","streetAddress":"ul. Marsza\u0142kowska 80","postalCode":"00-517","addressLocality":"Warszawa","addressCountry":"PL"},"email":"lab@nonsensia.pl"},{"@type":"Person","@id":"https:\/\/nonsensia.pl\/#\/schema\/person\/97c0a8a75ea8c654fd606679bb6d01fb","name":"Thomas Reyner","image":{"@type":"ImageObject","inLanguage":"pl-PL","@id":"https:\/\/secure.gravatar.com\/avatar\/17721409ed81a1e4666b08b23530653af17971df2e2cde4fad397c4da1e60ba7?s=96&d=mm&r=g","url":"https:\/\/secure.gravatar.com\/avatar\/17721409ed81a1e4666b08b23530653af17971df2e2cde4fad397c4da1e60ba7?s=96&d=mm&r=g","contentUrl":"https:\/\/secure.gravatar.com\/avatar\/17721409ed81a1e4666b08b23530653af17971df2e2cde4fad397c4da1e60ba7?s=96&d=mm&r=g","caption":"Thomas Reyner"},"description":"Pisze o spektroskopii, ustalaniu struktur zwi\u0105zk\u00f3w i aparaturze laboratoryjnej dla Nonsensia.","url":"https:\/\/nonsensia.pl\/pl\/author\/treyner\/"},{"@type":"ImageObject","inLanguage":"pl-PL","@id":"https:\/\/nonsensia.pl\/2026\/10\/30\/hplc-purity-number-area-normalisation\/#local-main-organization-logo","url":"https:\/\/nonsensia.pl\/wp-content\/uploads\/2024\/12\/cropped-Nonsensia_Logo-8.png","contentUrl":"https:\/\/nonsensia.pl\/wp-content\/uploads\/2024\/12\/cropped-Nonsensia_Logo-8.png","width":512,"height":512,"caption":"Nonsensia"}]}},"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/nonsensia.pl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/11738","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/nonsensia.pl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/nonsensia.pl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/types\/post"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/nonsensia.pl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/users\/517"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/nonsensia.pl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=11738"}],"version-history":[{"count":2,"href":"https:\/\/nonsensia.pl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/11738\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":12009,"href":"https:\/\/nonsensia.pl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/11738\/revisions\/12009"}],"wp:featuredmedia":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/nonsensia.pl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/media\/11780"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/nonsensia.pl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=11738"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/nonsensia.pl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=11738"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/nonsensia.pl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=11738"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}