Un chromatogramme est un trac\u00e9 du signal du d\u00e9tecteur en fonction du temps. Ce n\u2019est pas un trac\u00e9 de la masse en fonction du temps. Presque tous les malentendus relatifs \u00e0 la puret\u00e9 se nichent dans l\u2019\u00e9cart entre ces deux phrases.<\/p>\n
Que signifie donc une puret\u00e9 HPLC de 99 pour cent lorsqu\u2019elle figure sur un certificat\u00a0? Dans la plupart des cas, cela signifie exactement une chose\u00a0: que 99 pour cent de l\u2019aire totale des pics int\u00e9gr\u00e9s dans un unique chromatogramme, enregistr\u00e9 avec un seul d\u00e9tecteur \u00e0 une seule longueur d\u2019onde, appartenaient \u00e0 un seul pic. C\u2019est un rapport d\u2019aires. Ce n\u2019est pas, \u00e0 soi seul, une indication du nombre de milligrammes contenus dans le flacon qui correspondent au compos\u00e9 command\u00e9.<\/p>\n
Les deux valeurs peuvent diverger dans les deux sens, et rien sur le chromatogramme n\u2019indique dans quel sens.<\/p>\n
La technique qui sous-tend cette valeur est la normalisation des aires<\/strong>. Chaque pic de la s\u00e9paration est int\u00e9gr\u00e9, les aires sont additionn\u00e9es et chaque pic est rapport\u00e9 en pourcentage de cette somme. Aucun \u00e9talon externe n\u2019est pes\u00e9, aucune courbe d\u2019\u00e9talonnage n\u2019est \u00e9tablie. La m\u00e9thode est rapide, n\u2019exige aucun \u00e9chantillon authentique d\u2019impuret\u00e9 et fonctionne sur des compos\u00e9s que personne n\u2019a isol\u00e9s.<\/p>\n Elle repose aussi sur trois hypoth\u00e8ses tacites\u00a0:<\/p>\n Ces trois hypoth\u00e8ses sont des approximations. La troisi\u00e8me est la plus souvent fausse, et elle l\u2019est sans bruit.<\/p>\n Un d\u00e9tecteur ultraviolet mesure l\u2019absorbance \u00e0 une longueur d\u2019onde choisie. L\u2019absorbance d\u00e9pend de la structure \u00e9lectronique de la mol\u00e9cule qui traverse la cellule de mesure. Deux compos\u00e9s pr\u00e9sents \u00e0 des concentrations identiques ne donneront des aires de pic identiques que s\u2019ils absorbent de la m\u00eame mani\u00e8re \u00e0 cette longueur d\u2019onde, ce qui rel\u00e8ve de la co\u00efncidence plut\u00f4t que de la r\u00e8gle.<\/p>\n Le rapport entre les deux porte un nom\u00a0: le facteur de r\u00e9ponse relatif<\/strong> (RRF). Un exemple publi\u00e9 rend l\u2019\u00e9chelle concr\u00e8te. Dans une \u00e9tude des impuret\u00e9s indicatrice de stabilit\u00e9 portant sur l\u2019antipaludique lum\u00e9fantrine, le d\u00e9riv\u00e9 desbenzylc\u00e9to (DBK) a \u00e9t\u00e9 quantifi\u00e9 par rapport \u00e0 la lum\u00e9fantrine \u00e0 266 nm, et son facteur de r\u00e9ponse relatif a \u00e9t\u00e9 d\u00e9termin\u00e9 exp\u00e9rimentalement \u00e0 2,87 – le rapport de l\u2019aire du pic du compos\u00e9 \u00e0 l\u2019aire du pic de la lum\u00e9fantrine \u00e0 la m\u00eame concentration. Une masse \u00e9gale de DBK g\u00e9n\u00e8re donc pr\u00e8s de trois fois le signal. Lue en pourcentage d\u2019aire brut, cette impuret\u00e9 est surestim\u00e9e d\u2019un facteur d\u2019environ trois.<\/p>\n Les autorit\u00e9s r\u00e9glementaires traitent ce point comme un probl\u00e8me connu et born\u00e9. La ligne directrice ICH relative \u00e0 la validation des proc\u00e9dures analytiques, Q2(R2), adopt\u00e9e en novembre 2023, pr\u00e9cise que lorsqu\u2019un analyte pr\u00e9sente une r\u00e9ponse diff\u00e9rente de celle du mat\u00e9riau de r\u00e9f\u00e9rence – par exemple une absorbance UV sp\u00e9cifique diff\u00e9rente – les facteurs de r\u00e9ponse relatifs doivent \u00eatre calcul\u00e9s \u00e0 partir du rapport appropri\u00e9 des r\u00e9ponses, et que si le facteur de r\u00e9ponse relatif se situe en dehors de l\u2019intervalle 0,8-1,2, un facteur de correction doit alors \u00eatre appliqu\u00e9<\/em>. Le m\u00eame passage ajoute une exemption r\u00e9v\u00e9latrice\u00a0: si une impuret\u00e9 ou un produit de d\u00e9gradation est surestim\u00e9, il peut \u00eatre acceptable de ne pas appliquer de correction. L\u2019asym\u00e9trie est d\u00e9lib\u00e9r\u00e9e. Surestimer une impuret\u00e9 est prudent\u00a0; la sous-estimer ne l\u2019est pas.<\/p>\n La normalisation des aires ne peut r\u00e9partir que ce que le d\u00e9tecteur a vu. Plusieurs cat\u00e9gories enti\u00e8res de mati\u00e8re en sont exclues par construction.<\/p>\n Un r\u00e9sultat de 99,5 pour cent d\u2019aire est donc une affirmation portant sur la fraction de l\u2019\u00e9chantillon qui absorbe dans l\u2019UV et qui est \u00e9lu\u00e9e de la colonne. Tout le reste doit \u00eatre \u00e9tabli par une autre mesure, ou ne l\u2019est pas du tout.<\/p>\n Le vocabulaire employ\u00e9 sur la plupart des certificats provient de l\u2019ICH Q3A(R2), Impuret\u00e9s dans les nouvelles substances m\u00e9dicamenteuses<\/em>, dont la version \u00c9tape 4 en vigueur est dat\u00e9e du 25 octobre 2006. Elle d\u00e9finit trois seuils, li\u00e9s \u00e0 la dose journali\u00e8re maximale d\u2019un m\u00e9dicament\u00a0: un seuil de d\u00e9claration<\/strong> au-del\u00e0 duquel une impuret\u00e9 doit \u00eatre rapport\u00e9e, un seuil d\u2019identification<\/strong> au-del\u00e0 duquel elle doit \u00eatre identifi\u00e9e structurellement, et un seuil de qualification<\/strong> au-del\u00e0 duquel sa s\u00e9curit\u00e9 biologique doit \u00eatre \u00e9tablie. Pour une dose journali\u00e8re maximale inf\u00e9rieure ou \u00e9gale \u00e0 2 g\/jour, la ligne directrice fixe ces seuils \u00e0 0,05 pour cent, 0,10 pour cent (ou un apport de 1,0 mg par jour, la valeur la plus faible \u00e9tant retenue) et 0,15 pour cent (ou un apport de 1,0 mg par jour, la valeur la plus faible \u00e9tant retenue). Au-del\u00e0 de 2 g\/jour, ils sont resserr\u00e9s \u00e0 0,03, 0,05 et 0,05 pour cent.<\/p>\n Deux d\u00e9tails de Q3A m\u00e9ritent une lecture attentive. Premi\u00e8rement, le texte admet que la substance active elle-m\u00eame peut servir d\u2019\u00e9talon pour estimer les teneurs en impuret\u00e9s, et que lorsque les facteurs de r\u00e9ponse ne sont pas proches, cela reste appropri\u00e9 \u00e0 condition qu\u2019un facteur de correction soit appliqu\u00e9 ou que les impuret\u00e9s soient effectivement surestim\u00e9es. Deuxi\u00e8mement, il indique que les crit\u00e8res d\u2019acceptation et les proc\u00e9dures d\u2019estimation des impuret\u00e9s peuvent reposer sur des hypoth\u00e8ses analytiques (par exemple, une r\u00e9ponse \u00e9quivalente du d\u00e9tecteur)<\/em>, et que ces hypoth\u00e8ses doivent \u00eatre discut\u00e9es dans le dossier. La ligne directrice ne pr\u00e9tend pas que le pourcentage d\u2019aire est \u00e9gal au pourcentage massique. Elle exige que vous d\u00e9clariez explicitement que vous le supposez.<\/p>\n Ces seuils rel\u00e8vent des m\u00e9dicaments et sont index\u00e9s sur la dose journali\u00e8re\u00a0: ils ne se transposent donc pas directement \u00e0 un r\u00e9actif de catalogue. Ils restent le vocabulaire commun le plus utile pour discuter de ce qu\u2019affirme un certificat.<\/p>\n Lorsqu\u2019une valeur de puret\u00e9 doit avoir un poids m\u00e9trologique, la normalisation des aires est remplac\u00e9e par une approche de bilan massique<\/strong> : chaque classe d\u2019impuret\u00e9s est mesur\u00e9e par une technique adapt\u00e9e, et le total est soustrait de 100 pour cent. Une \u00e9tude de 2024 attribuant la puret\u00e9 du phosphate de tripropyle d\u00e9crit la m\u00e9thode comme une approche indirecte qui mesure s\u00e9par\u00e9ment la teneur en diff\u00e9rents types d\u2019impuret\u00e9s et les d\u00e9duit de 100 pour cent, en couvrant les impuret\u00e9s organiques li\u00e9es \u00e0 la structure, l\u2019eau, les solvants organiques r\u00e9siduels et les impuret\u00e9s inorganiques – dans ce travail, respectivement par chromatographie, titrage Karl Fischer, CPG en espace de t\u00eate avec d\u00e9tection par ionisation de flamme, et ICP-MS.<\/p>\n Le bilan massique a sa propre faiblesse\u00a0: il ne peut soustraire que les impuret\u00e9s que quelqu\u2019un a song\u00e9 \u00e0 rechercher. La m\u00eame \u00e9tude l\u2019associe \u00e0 la RMN quantitative, car la qRMN r\u00e9pond \u00e0 la limite du bilan massique, qui risque de ne pas identifier toutes les impuret\u00e9s.<\/p>\n\n
Pourquoi l\u2019aire d\u2019un pic est un signal de d\u00e9tecteur et non une quantit\u00e9 de mati\u00e8re<\/h2>\n
Ce que le chromatogramme ne vous montre jamais<\/h2>\n
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Comment l\u2019ICH Q3A encadre la valeur que vous lisez<\/h2>\n
Normalisation des aires et bilan massique\u00a0: deux questions diff\u00e9rentes<\/h2>\n