{"id":11738,"date":"2026-10-30T10:38:25","date_gmt":"2026-10-30T10:38:25","guid":{"rendered":"https:\/\/nonsensia.pl\/?p=11738"},"modified":"2026-10-21T07:56:53","modified_gmt":"2026-10-21T07:56:53","slug":"hplc-purity-number-area-normalisation","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/nonsensia.pl\/de\/2026\/10\/30\/hplc-purity-number-area-normalisation\/","title":{"rendered":"Was eine HPLC-Reinheitszahl tats\u00e4chlich misst"},"content":{"rendered":"<p>Ein Chromatogramm ist eine Auftragung des Detektorsignals gegen die Zeit. Es ist keine Auftragung der Masse gegen die Zeit. Nahezu jedes Missverst\u00e4ndnis \u00fcber die Reinheit liegt in der L\u00fccke zwischen diesen beiden S\u00e4tzen.<\/p>\n<p>Was bedeutet also eine HPLC-Reinheit von 99 Prozent, wenn sie auf einem Analysenzertifikat erscheint? In den meisten F\u00e4llen bedeutet sie genau eines: dass 99 Prozent der gesamten integrierten Peakfl\u00e4che in einem einzigen Chromatogramm, aufgezeichnet mit einem einzigen Detektor bei einer einzigen Wellenl\u00e4nge, zu einem einzigen Peak geh\u00f6rten. Das ist ein Fl\u00e4chenverh\u00e4ltnis. Es ist f\u00fcr sich genommen keine Aussage dar\u00fcber, wie viele Milligramm im Fl\u00e4schchen die Verbindung sind, die Sie bestellt haben.<\/p>\n<p>Die beiden Zahlen k\u00f6nnen in beide Richtungen voneinander abweichen, und nichts im Chromatogramm sagt, in welche.<\/p>\n<h2>Was eine HPLC-Reinheit von 99 Prozent bedeutet und was nicht<\/h2>\n<p>Die Technik hinter der Zahl ist die <strong>Fl\u00e4chennormalisierung<\/strong>. Jeder Peak im Lauf wird integriert, die Fl\u00e4chen werden summiert, und jeder Peak wird als Prozentsatz dieser Summe angegeben. Es wird kein externer Standard eingewogen, es wird keine Kalibrierkurve erstellt. Das Verfahren ist schnell, ben\u00f6tigt keine authentische Verunreinigungsprobe und funktioniert bei Verbindungen, die niemand isoliert hat.<\/p>\n<p>Es beruht zudem auf drei stillschweigenden Annahmen:<\/p>\n<ul>\n<li>alles, was in der Probe vorhanden ist, verl\u00e4sst die S\u00e4ule w\u00e4hrend des Laufs;<\/li>\n<li>alles, was die S\u00e4ule verl\u00e4sst, erzeugt ein Signal im Detektor;<\/li>\n<li>gleiche Massen unterschiedlicher Verbindungen erzeugen gleiche Signale.<\/li>\n<\/ul>\n<p>Alle drei sind N\u00e4herungen. Die dritte versagt am h\u00e4ufigsten, und sie versagt unbemerkt.<\/p>\n<h2>Warum eine Peakfl\u00e4che ein Detektorsignal ist und keine Menge an Materie<\/h2>\n<p>Ein Ultraviolettdetektor misst die Absorption bei einer gew\u00e4hlten Wellenl\u00e4nge. Die Absorption h\u00e4ngt von der elektronischen Struktur des Molek\u00fcls ab, das die Durchflusszelle passiert. Zwei Verbindungen, die in identischen Konzentrationen vorliegen, ergeben nur dann identische Peakfl\u00e4chen, wenn sie bei dieser Wellenl\u00e4nge identisch absorbieren, was ein Zufall und keine Regel ist.<\/p>\n<p class=\"translation-block\">Das Verh\u00e4ltnis zwischen ihnen tr\u00e4gt die Bezeichnung <strong>relativer Responsefaktor<\/strong> (RRF). Ein ver\u00f6ffentlichtes Beispiel macht die Gr\u00f6\u00dfenordnung konkret. In einer stabilit\u00e4tsindizierenden Verunreinigungsstudie zum Antimalariamittel Lumefantrin wurde das Desbenzylketo-Derivat (DBK) gegen Lumefantrin bei 266 nm quantifiziert, und sein relativer Responsefaktor wurde experimentell als 2,87 bestimmt &#8211; das Verh\u00e4ltnis der Peakfl\u00e4che der Verbindung zur Peakfl\u00e4che von Lumefantrin bei gleicher Konzentration. Eine gleiche Masse DBK erzeugt daher nahezu das Dreifache des Signals. Als roher Fl\u00e4chenprozentwert gelesen, wird diese Verunreinigung um etwa den Faktor drei \u00fcbersch\u00e4tzt.<\/p>\n<p>Die Regulierungsbeh\u00f6rden behandeln dies als ein bekanntes, begrenztes Problem. Die ICH-Richtlinie zur Validierung analytischer Verfahren, Q2(R2), angenommen im November 2023, legt fest, dass, wenn ein Analyt ein anderes Ansprechverhalten als das Referenzmaterial aufweist &#8211; beispielsweise eine andere spezifische UV-Absorption &#8211;, relative Responsefaktoren aus dem geeigneten Verh\u00e4ltnis der Ansprechverhalten berechnet werden sollten, und dass <em>wenn der relative Responsefaktor au\u00dferhalb des Bereichs 0,8\u20131,2 liegt, ein Korrekturfaktor angewendet werden sollte<\/em>. Dieselbe Passage f\u00fcgt eine bezeichnende Ausnahme hinzu: Wenn eine Verunreinigung oder ein Abbauprodukt \u00fcbersch\u00e4tzt wird, kann es akzeptabel sein, keine Korrektur vorzunehmen. Die Asymmetrie ist beabsichtigt. Eine Verunreinigung zu \u00fcbersch\u00e4tzen ist konservativ; sie zu untersch\u00e4tzen ist es nicht.<\/p>\n<h2>Was das Chromatogramm Ihnen nie zeigt<\/h2>\n<p>Die Fl\u00e4chennormalisierung kann nur das aufteilen, was der Detektor gesehen hat. Mehrere ganze Materialklassen liegen konstruktionsbedingt au\u00dferhalb dieser Menge.<\/p>\n<ul>\n<li><strong>Verbindungen ohne Chromophor.<\/strong> Wenn einem Wirkstoff oder einigen seiner Verunreinigungen ein UV-absorbierendes Chromophor fehlt, werden sie in einer routinem\u00e4\u00dfigen HPLC-Analyse nur mit einem UV-Detektor nicht detektiert, und es muss ein alternatives Detektionsschema verwendet werden.<\/li>\n<li><strong>Restl\u00f6sungsmittel.<\/strong> ICH Q3C(R9) stellt klar fest, dass Restl\u00f6sungsmittel typischerweise mit chromatographischen Verfahren wie der Gaschromatographie bestimmt werden. Sie sind eine separate Pr\u00fcfung, \u00fcblicherweise mittels Headspace-GC, und kein Peak in Ihrem Fl\u00fcssigchromatogramm.<\/li>\n<li><strong>Wasser.<\/strong> Die Karl-Fischer-Titration ist der Standardweg zur Bestimmung des Wassergehalts in organischen Substanzen. Wasser ist f\u00fcr einen UV-Detektor im Allgemeinen unsichtbar und ist nicht Teil einer Fl\u00e4chenprozentangabe.<\/li>\n<li><strong>Elementare Verunreinigungen.<\/strong> ICH Q3D(R2) verlangt, dass die Pr\u00fcfung, sofern nicht anders begr\u00fcndet, f\u00fcr jede zur Kontrolle identifizierte elementare Verunreinigung spezifisch ist und Arzneibuch- oder geeignete alternative Verfahren verwendet werden. Katalysatorr\u00fcckst\u00e4nde und Metalle werden mit Verfahren wie ICP-MS gemessen, niemals durch Peakintegration.<\/li>\n<li><strong>Material, das niemals eluiert.<\/strong> Stark zur\u00fcckgehaltene oder unl\u00f6sliche Bestandteile tragen \u00fcberhaupt keine Fl\u00e4che bei und k\u00f6nnen daher nicht im Nenner erscheinen.<\/li>\n<\/ul>\n<p>Ein Ergebnis von 99,5 Fl\u00e4chenprozent ist daher eine Aussage \u00fcber den UV-aktiven, von der S\u00e4ule eluierenden Anteil der Probe. Alles andere muss durch eine andere Messung ermittelt werden oder gar nicht.<\/p>\n<h2>Wie ICH Q3A die Zahl einordnet, die Sie gerade lesen<\/h2>\n<p class=\"translation-block\">Die auf den meisten Analysenzertifikaten verwendete Terminologie stammt aus ICH Q3A(R2), <em>Impurities in New Drug Substances<\/em>, deren aktuelle Step-4-Fassung vom 25. Oktober 2006 datiert. Sie definiert drei Schwellenwerte, gebunden an die maximale Tagesdosis eines Arzneimittels: eine <strong>Meldeschwelle<\/strong>, oberhalb derer eine Verunreinigung gemeldet werden sollte, eine <strong>Identifizierungsschwelle<\/strong>, oberhalb derer sie strukturell identifiziert werden sollte, und eine <strong>Qualifizierungsschwelle<\/strong>, oberhalb derer ihre biologische Sicherheit belegt werden sollte. F\u00fcr eine maximale Tagesdosis von 2 g\/Tag oder weniger legt die Leitlinie diese auf 0,05 Prozent, 0,10 Prozent (oder 1,0 mg pro Tag Aufnahme, je nachdem, welcher Wert niedriger ist) und 0,15 Prozent (oder 1,0 mg pro Tag Aufnahme, je nachdem, welcher Wert niedriger ist) fest. Oberhalb von 2 g\/Tag versch\u00e4rfen sie sich auf 0,03, 0,05 und 0,05 Prozent.<\/p>\n<p>Zwei Details in Q3A verdienen eine langsame Lekt\u00fcre. Erstens wird anerkannt, dass der Arzneistoff selbst als Standard zur Sch\u00e4tzung von Verunreinigungsgehalten verwendet werden kann und dass dies, wo die Responsefaktoren nicht nahe beieinanderliegen, angemessen bleibt, sofern ein Korrekturfaktor angewendet wird oder die Verunreinigungen tats\u00e4chlich \u00fcbersch\u00e4tzt werden. Zweitens hei\u00dft es, dass Akzeptanzkriterien und Verfahren zur Sch\u00e4tzung von Verunreinigungen <em>auf analytischen Annahmen (z. B. \u00e4quivalentem Detektoransprechen) beruhen k\u00f6nnen<\/em>, und dass diese Annahmen im Antrag er\u00f6rtert werden sollten. Die Leitlinie gibt nicht vor, dass Fl\u00e4chenprozent gleich Massenprozent ist. Sie verlangt, dass Sie ausdr\u00fccklich sagen, dass Sie es annehmen.<\/p>\n<p>Diese Schwellenwerte geh\u00f6ren zu Arzneimitteln und sind an die Tagesdosis gekoppelt, sodass sie nicht direkt auf ein Katalogreagenz \u00fcbertragbar sind. Sie bleiben das n\u00fctzlichste gemeinsame Vokabular, um zu er\u00f6rtern, was ein Analysenzertifikat aussagt.<\/p>\n<h2>Fl\u00e4chennormalisierung versus Massenbilanz: zwei verschiedene Fragen<\/h2>\n<p class=\"translation-block\">Wenn ein Reinheitswert metrologisches Gewicht tragen muss, wird die Fl\u00e4chennormalisierung durch einen <strong>Massenbilanz<\/strong>-Ansatz ersetzt: Jede Klasse von Verunreinigungen wird mit einem daf\u00fcr geeigneten Verfahren gemessen, und die Summe wird von 100 Prozent abgezogen. Eine Studie aus dem Jahr 2024, die die Reinheit von Tripropylphosphat bestimmt, beschreibt das Verfahren als indirektes Verfahren, das den Gehalt verschiedener Arten von Verunreinigungen separat misst und sie von 100 Prozent abzieht, wobei strukturbezogene organische Verunreinigungen, Wasser, restliche organische L\u00f6sungsmittel und anorganische Verunreinigungen abgedeckt werden &#8211; in dieser Arbeit mittels Chromatographie, Karl-Fischer-Titration, Headspace-GC mit Flammenionisationsdetektion bzw. ICP-MS.<\/p>\n<p>Die Massenbilanz hat ihre eigene Schw\u00e4che: Sie kann nur Verunreinigungen abziehen, nach denen jemand gezielt gesucht hat. Dieselbe Studie kombiniert sie mit quantitativer NMR, weil qNMR die Einschr\u00e4nkung adressiert, dass die Massenbilanz m\u00f6glicherweise nicht alle Verunreinigungen identifiziert.<\/p>\n<table>\n<tr>\n<th>Ansatz<\/th>\n<th>Frage, die sie beantwortet<\/th>\n<th>Schl\u00fcsselannahme<\/th>\n<th>Typische Verfahren<\/th>\n<\/tr>\n<tr>\n<td>Fl\u00e4chennormalisierung<\/td>\n<td>Welcher Anteil des detektierten Signals ist der Hauptpeak?<\/td>\n<td>Gleiches Detektoransprechen pro Masseneinheit<\/td>\n<td>HPLC-UV, HPLC-DAD, GC-FID<\/td>\n<\/tr>\n<tr>\n<td>Gehalt gegen einen Standard<\/td>\n<td>Wie viel Analyt ist in der Probe relativ zu einer Referenz enthalten?<\/td>\n<td>Die Reinheit des Referenzmaterials selbst ist bekannt<\/td>\n<td>HPLC mit externem oder internem Standard<\/td>\n<\/tr>\n<tr>\n<td>Massenbilanz<\/td>\n<td>Was ist alles, was nicht der Analyt ist?<\/td>\n<td>Nach allen Verunreinigungsklassen wurde gesucht<\/td>\n<td>HPLC, Karl Fischer, Headspace-GC-FID, ICP-MS<\/td>\n<\/tr>\n<tr>\n<td>Quantitative NMR<\/td>\n<td>Welcher Massenanteil ist der Analyt, direkt gemessen?<\/td>\n<td>Saubere, integrierbare, zuordenbare Signale<\/td>\n<td>1H- oder 31P-qNMR gegen einen zertifizierten Standard<\/td>\n<\/tr>\n<\/table>\n<h2>Ein Analysenzertifikat lesen, ohne es zu \u00fcberinterpretieren<\/h2>\n<p>F\u00fcnf Fragen unterscheiden einen Reinheitswert, den Sie verwenden k\u00f6nnen, von einem, den Sie nur zitieren k\u00f6nnen.<\/p>\n<ol>\n<li><strong>Methode und Detektor.<\/strong> HPLC-UV, HPLC-CAD, GC-FID und qNMR beantworten unterschiedliche Fragen und sind nicht austauschbar.<\/li>\n<li><strong>Wellenl\u00e4nge.<\/strong> Ein bei 254 nm aufgezeichneter Prozentwert und ein bei 210 nm aufgezeichneter k\u00f6nnen dasselbe Fl\u00e4schchen beschreiben und sich widersprechen.<\/li>\n<li><strong>Fl\u00e4chenprozent oder Gehalt.<\/strong> Ein Fl\u00e4chenprozent hat keine externe Referenz; ein Gehalt hat eine. Nur einer von beiden ist auf eine Masse r\u00fcckf\u00fchrbar.<\/li>\n<li><strong>Responsefaktoren.<\/strong> Wurden RRFs bestimmt, und wurden Korrekturfaktoren angewendet, wo sie au\u00dferhalb von 0,8-1,2 lagen?<\/li>\n<li><strong>Die separaten Pr\u00fcfungen.<\/strong> Wasser, Restl\u00f6sungsmittel und Elementverunreinigungen ben\u00f6tigen jeweils eine eigene Zeile auf dem Dokument.<\/li>\n<\/ol>\n<p>Zwei Chargen k\u00f6nnen beide 99,5 Prozent anzeigen und sich darin unterscheiden, was die verbleibenden 0,5 Prozent enthalten, wie viel davon tats\u00e4chlich vorhanden ist und wie viel nie ins Chromatogramm gelangt ist. F\u00fcr Material, das als <a href=\"https:\/\/nonsensia.pl\/de\/rules\/\">analytische Referenz in der Laborarbeit<\/a>verwendet wird, ist dieser Unterschied der eigentliche Zweck der Dokumentation.<\/p>\n<h2>H\u00e4ufig gestellte Fragen<\/h2>\n<h3>Was bedeutet 99 Prozent Reinheit mittels HPLC tats\u00e4chlich?<\/h3>\n<p>\u00dcblicherweise bedeutet es, dass 99 Prozent der gesamten integrierten Peakfl\u00e4che in einem Chromatogramm zum Hauptpeak geh\u00f6rten. Es ist ein Verh\u00e4ltnis des Detektorsignals, nicht der Masse. Es gilt nur f\u00fcr Substanzen, die von der S\u00e4ule eluiert wurden und bei der verwendeten Wellenl\u00e4nge ein Signal im verwendeten Detektor erzeugten.<\/p>\n<h3>Ist der HPLC-Fl\u00e4chenprozentwert dasselbe wie ein Gehaltsergebnis?<\/h3>\n<p>Nein. Ein Fl\u00e4chenprozentwert ist intern auf ein einzelnes Chromatogramm bezogen und verwendet keine externe Referenz. Ein Gehalt vergleicht das Analyt-Signal mit einem eingewogenen Referenzmaterial bekannten Gehalts, wodurch er auf die Masse r\u00fcckf\u00fchrbar ist. Die beiden Werte unterscheiden sich f\u00fcr dieselbe Probe h\u00e4ufig und beantworten unterschiedliche Fragen.<\/p>\n<h3>Schlie\u00dft ein HPLC-Reinheitswert Wasser und Restl\u00f6sungsmittel ein?<\/h3>\n<p>Im Allgemeinen nicht. Wasser wird durch Karl-Fischer-Titration bestimmt, und ICH Q3C(R9) merkt an, dass Restl\u00f6sungsmittel typischerweise mit chromatographischen Techniken wie der Gaschromatographie bestimmt werden. Keines von beiden erscheint als integrierter Peak in einem routinem\u00e4\u00dfigen Umkehrphasen-HPLC-UV-Lauf, daher wird keines von beiden in einem Fl\u00e4chenprozentwert abgezogen.<\/p>\n<h3>Was ist eine Meldegrenze in ICH Q3A?<\/h3>\n<p>ICH Q3A(R2) definiert die Meldegrenze als eine Grenze, oberhalb derer eine Verunreinigung gemeldet werden sollte. Bei einer maximalen Tagesdosis von 2 g\/Tag oder weniger ist sie auf 0,05 Prozent festgelegt; oberhalb von 2 g\/Tag versch\u00e4rft sie sich auf 0,03 Prozent. Die Leitlinie verlangt au\u00dferdem, dass die Bestimmungsgrenze des Verfahrens nicht h\u00f6her als diese Grenze ist.<\/p>\n<h3>Warum k\u00f6nnen zwei Chargen mit derselben Reinheit unterschiedliche Verunreinigungsprofile haben?<\/h3>\n<p>Weil der Fl\u00e4chenprozentwert eine Summe beschreibt, keine Zusammensetzung. Unterschiedliche Synthesen, L\u00f6sungsmittel und Lagerungshistorien erzeugen unterschiedliche verwandte Substanzen, und jede davon hat ihr eigenes Detektorsignal. Derselbe ausgewiesene Gesamtwert kann daher unterschiedlichen Substanzen entsprechen, die in unterschiedlichen tats\u00e4chlichen Mengen vorhanden sind.<\/p>\n<h3>Kann HPLC jede Verunreinigung in einer Probe detektieren?<\/h3>\n<p>Nein. Verbindungen ohne UV-absorbierenden Chromophor werden von einem UV-Detektor nicht gesehen, anorganische und Elementverunreinigungen erfordern elementspezifische Verfahren nach ICH Q3D(R2), fl\u00fcchtige L\u00f6sungsmittel werden gaschromatographisch behandelt, und alles, was nicht eluiert, tr\u00e4gt keinen Peak bei. Eine vollst\u00e4ndige Charakterisierung erfordert mehrere orthogonale Methoden.<\/p>\n<h2>Literatur<\/h2>\n<ol>\n<li><a href=\"https:\/\/database.ich.org\/sites\/default\/files\/Q3A(R2)%20Guideline.pdf\" rel=\"nofollow noopener\" target=\"_blank\">ICH, Verunreinigungen in neuen Arzneistoffen Q3A(R2), Fassung der Stufe 4 vom 25. Oktober 2006<\/a><\/li>\n<li><a href=\"https:\/\/database.ich.org\/sites\/default\/files\/ICH_Q2(R2)_Guideline_2023_1130.pdf\" rel=\"nofollow noopener\" target=\"_blank\">ICH, Validation of Analytical Procedures Q2(R2), Endfassung angenommen am 1. November 2023<\/a><\/li>\n<li><a href=\"https:\/\/database.ich.org\/sites\/default\/files\/ICH_Q3C(R9)_Guideline_MinorRevision_2024_2024_Approved.pdf\" rel=\"nofollow noopener\" target=\"_blank\">ICH, Verunreinigungen: Leitlinie f\u00fcr Restl\u00f6sungsmittel Q3C(R9), Fassung der Stufe 4 vom 24. Januar 2024<\/a><\/li>\n<li><a href=\"https:\/\/database.ich.org\/sites\/default\/files\/Q3D-R2_Guideline_Step4_2022_0308.pdf\" rel=\"nofollow noopener\" target=\"_blank\">ICH, Guideline for Elemental Impurities Q3D(R2), angenommen am 26. April 2022<\/a><\/li>\n<li><a href=\"https:\/\/doi.org\/10.1186\/1475-2875-10-51\" rel=\"nofollow noopener\" target=\"_blank\">Verbeken M. et al., Stabilit\u00e4tsindizierende HPLC-DAD\/UV-ESI\/MS-Verunreinigungsprofilierung des Antimalariamittels Lumefantrin, Malaria Journal, 2011<\/a><\/li>\n<li><a href=\"https:\/\/doi.org\/10.3390\/molecules29091975\" rel=\"nofollow noopener\" target=\"_blank\">Wan Y. et al., Reinheitsbewertung von Tripropylphosphat mittels Massenbilanz und quantitativer 1H- und 31P-Kernspinresonanz, Molecules, 2024<\/a><\/li>\n<li><a href=\"https:\/\/doi.org\/10.1016\/j.chroma.2007.10.111\" rel=\"nofollow noopener\" target=\"_blank\">Vervoort N., Daemen D., Torok G., Performance evaluation of evaporative light scattering detection and charged aerosol detection in reversed phase liquid chromatography, Journal of Chromatography A, 2008<\/a><\/li>\n<\/ol>\n<hr \/>\n<p class=\"ns-disclaimer\"><strong>Nur f\u00fcr Forschungszwecke.<\/strong> Nonsensia liefert analytische Referenzstandards f\u00fcr Labor- und Forschungsanwendungen. Dieser Artikel wird zu wissenschaftlichen und Bildungszwecken ver\u00f6ffentlicht. Er ist keine medizinische Beratung, er beschreibt keine Anwendung am Menschen, und nichts darin darf als Empfehlung verstanden werden, einem Menschen oder Tier eine Substanz zu verabreichen.<\/p>","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Ein HPLC-Reinheitswert ist ein Verh\u00e4ltnis von Peakfl\u00e4chen, kein Verh\u00e4ltnis von Massen, und die beiden k\u00f6nnen in beide Richtungen auseinandergehen. Hier steht, was die Zahl voraussetzt, was sie stillschweigend ausschlie\u00dft und was auf einem Zertifikat zu pr\u00fcfen ist, bevor man ihr vertraut.<\/p>","protected":false},"author":517,"featured_media":11780,"comment_status":"closed","ping_status":"closed","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"footnotes":""},"categories":[385],"tags":[],"class_list":["post-11738","post","type-post","status-publish","format-standard","has-post-thumbnail","hentry","category-analytical-methods"],"yoast_head":"<!-- This site is optimized with the Yoast SEO plugin v27.9 - https:\/\/yoast.com\/product\/yoast-seo-wordpress\/ -->\n<title>What Does 99 Percent HPLC Purity Actually Mean?<\/title>\n<meta name=\"description\" content=\"Area normalisation, detector response factors and the impurities a chromatogram never shows. 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